我々の方法は、海馬のようなVivoで画像化することが困難であろう構造に位置する血管の研究を可能にする。血管は脳組織から取り除かれるため、毛細血管と動脈の間のシグナル伝達は、周囲の組織に対するオフターゲット効果なしに研究することができる。海馬を分離するには、小さな解剖ハサミを使用して、マウスの頭の上の正中線に沿って皮膚を切断し、皮膚を側面に移動させます。
頭蓋骨の尾側から始めて、嗅球に達するまで正中線に沿って頭蓋骨を切断し、大脳が露出するまで頭蓋骨の一部を取り除きます。マウスの鼻付近から、耳鼻をゆっくりと取り除き、はさみを使って嗅球、頭蓋神経、脊髄を切り抜けます。脳を沈め、腹側をMOPS緩衝生理液線に下に下に、解剖板の中央に、解剖顕微鏡の下に置く。
皿の底に平行に鋭い端を保持し、1ストロークで縦方向の裂け目に沿って半分に脳をカットするためにカミソリの刃を使用しています。中線を下に向けてプレートの中央に1つの半球を置き、横の裂け目に沿って組織を通してカミソリの刃をまっすぐに押して、小脳と脳幹を取り除きます。内側側が上向きになるように半球を回転させ、ヘラを使って脳を所定の位置に保持します。
脳梁の下に2番目のヘラの先端を挿入し、組織の下にすくい、海馬から視床、中隔、視床下部を取り除きます。海馬は大脳の後部側付近の湾曲した構造として見えるはずです。1つのへらを使って大脳を所定の位置に保持し、2番目のへらを使って大脳から海馬をすくい取ります。
その後、新鮮なMOP溶液で約半分を充填した新しい解剖プレートに海馬を転送します。海馬動脈分離の場合は、1つの海馬の両端に小さなピンを置き、海馬動脈側のサンプルを固定します。非常に鋭い鉗子を使用して、海馬の小さな部分を穏やかに伸ばして、細動脈を取り巻く組織を緩める。
そして、外部横動脈を識別するために、側側海馬組織を検索します。動脈が配置されたら、海馬から外部横動脈をつかみ、ゆっくりと組織から引き離して細動脈と毛細血管を採取する。各海馬からの動脈は別々に除去される。
除去する血管がなくなったら、サンプルを氷の上に置き、残りの海馬組織を捨てます。細動脈のカンヌレーションのために、毛細血管で終わる枝を持つ動脈を見つけ、動脈を臓器室に入れる。カニューレ先端を標的領域の下の動脈壁に慎重に押し込み、血管を装着します。
その後、慎重にネクタイを配置するのに十分な組織があるまでカニューレに容器をスライドさせます。血管とカニューレの上に収まる緩い結び目を作るために12-0ナイロン縫合糸を使用し、ネクタイを固定するために半分のヒッチ結び目を使用し、カニューレに動脈を固定するために結び目を引き締めるために端を引っ張ります。それを密封するために動脈の反対側の端に別のネクタイを固定します。
チャンバーの反対側で、カニューレのポイントが動脈の端のネクタイを下にピン留めするまで、2番目のカニューレを下げる。次に、3番目のカニューレを使用してキャピラリーブランチをカバースリップに固定し、先端を枝の端に近づけ、毛細血管の端部を露出させたままにします。脳の微小循環は絶妙に壊れやすいので、細動脈の生存を確実にするために、カヌレーション手順中に血管の伸張と取り扱いを最小限に抑えるようにしてください。
圧力ミノグラフィー解析のために、記録ソフトウェアを用いて、部屋を光顕微鏡の段階に移し、流入管と流出管をチャンバに接続して拡散させます。毎分4ミリリットルの流量で37°Cの人工脳脊髄液で拡散を開始し、圧力トランスデューサーと組み合わせた蠕動ポンプに加圧カニューレを取り付けます。内圧を20ミリメートルのMercuryに持ち込み、録音ソフトウェアを起動します。
顕微鏡と画像の設定を調整して、可能な限り鮮明な画像を実現します。そして、エッジ検出ソフトウェアを使用して、動脈が完全に拡張されたときに直径が約15〜30マイクロメートルであることを確認します。設定が最適化されたら、記録を開始し、血管内の血管内圧を最大40ミリメートルの水銀まで増加させ、エッジ検出ソフトウェアで動脈径を記録します。
その後、MOP溶液を洗い流すために15〜20分間チャンバーを使い果たします。血管の生存率をテストするために、1つのマイクロモルNS309溶液を浴拡散に適用し、動脈管セグメントは拡張する必要があり、30〜40%の筋性トーンを示す。動脈のベースライントーンが確立されたら、ガラスの引き手を使用して一端に細かい点を持つカニューレを作り、鉗子を使って各カニューレの先端を壊し、目的の薬物が1平方インチ当たり5ポンドの圧力で先端を滑らかに流ることができるようにします。
目的の薬でカニューレを埋めます.そして、顕微鏡に取り付けられた3軸マイクロマニピュレータにカニューレをロードします。圧力放出システムからカニューレにチューブを接続し、ゆっくりとキャピラリーの近くの浴槽にカニューレを下げ、容器またはチャンバーの一部に当たらないのに注意してください。
毛細血管を刺激するには、キャピラのすぐ隣にあるカバースリップにカニューレを下げ、所望の吐出時間で圧力放出システムを作動させます。刺激の終わりに、カニューレをわずかに上げて、さらなる刺激を避ける。毛細血管のみが刺激されていることを確認するには、新しいカニューレをNS309溶液の1つのマイクロモルで満たし、実証したように毛細血管を刺激します。
次いで、カルシウムフリー溶液で調製物を浴びることによって最大血管拡張を得る。1つのマイクロモルNS309の浴用途は、内皮のカルシウム感受性カリウムチャネルによる動脈動脈のほぼ最大拡張を引き起こす。しかし、毛細血管内皮細胞は、中間および小さい導電チャネルを欠き、アゴニストに応答して過分極を行わない、結果として、NS309で毛細血管の終了を刺激し、上流動脈拡張を引き起こさない、これはNS309が動脈に到達しなかったことを示し、そして、その制御として使用することができる
海馬毛細管の毛細血管の花頭動脈管製剤を用いて、毛細管末端に10ミリモルカリウムを添加した人工脳脊髄液を適用すると、男性マウスと雌マウスの調製物間で変わらない上流動脈拡張をもたらす。また、Kir2阻害剤ML133を添加すると、毛細管誘導動脈拡張を事実上廃止し、雄マウスと雌マウスの両方から調製した10ミリモルカリウムに応答する。血液ベッセルを取り付ける場合、血管との直接的な相互作用を制限して損傷を最小限に抑え、血管の生存率を高めます。
血管が単離されると、異なる薬物化合物を試験したり、オレキュラ生物学、免疫化学、または電気生理学の研究のために血管をさらに処理することができます。
