このプロトコルは、半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームでの異数性の移植前遺伝子検査における単一細胞増幅から最終報告データまでの手順を提示します。この手順は、視聴者がPGT-Aシーケンシングの実験ワークフローをよく理解し、半導体ベースのNGSプラットフォームを備えた診断ラボでこの手法を再現するのに役立ちます。まず、25マイクロリットルの全ゲノム増幅産物をピペッティングし、25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をプリロードした1.5ミリリットルの遠沈管に移します。
DNA精製ビーズを渦巻きして混合する。この溶液を50マイクロリットルずつサンプルチューブに分注します。渦と遠心分離を5秒間短時間行います。
DNA結合プロセスのために、チューブを室温で5分間セットします。1.5ミリリットルの遠沈管を磁気ラックに挿入します。次に、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで待ちます。
上清を新しい1.5ミリリットルの遠沈管に慎重に移します。ビーズをピペッティングしないでください。元のサンプル量によると。
30マイクロリットルの磁気ビーズ、ボルテックス、遠心分離機を5秒間短時間ピペットで入れます。DNA結合プロセスのために、チューブを室温で5分間セットします。1.5ミリメートルの遠心管を磁気ラックに挿入します。
次に、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで待ちます。上清を慎重に取り除き、廃棄します。ビーズをピペッティングしないでください。
300マイクロリットルの70%エタノールを1.5ミリリットルの遠沈管にピペットで入れます。次に、チューブを180度の角度で2回ゆっくりと回転させ、ビーズをチューブの壁に沿って動かして完全に洗浄します。上清をピペットで捨てる。
ビーズをピペッティングしないでください。洗浄手順を一度繰り返します。クリーンプログラムが完了したら、新しいアンププレートをシステムに配置します。
それぞれ150マイクロリットルの破砕溶液2が事前に充填された収集チューブをローターに挿入し、ブリッジを収集チューブに配置します。チューブの半分に反応油を加え、チューブの3分の1に乳化剤破砕溶液を加えます。テンプレート準備用の新しいフィルターを、サンプルポータルを上向きに配置したチューブラックに配置します。
溶液を5秒間ボルテックスし、5秒間短時間遠心分離します。次に、800マイクロリットルを3回ピペッティングした後、溶液をフィルターのサンプルポータルに移します。最後の注入の前にチューブを遠心分離して気泡を減らします。
フィルターに空気を注入しないでください。混合溶液に続いて、200マイクロリットルの反応油を2つ注入します。フィルターのサンプルポータルを下向きにし、洗浄アダプターをフィルターと交換します。
サンプル針をローター蓋の中央の穴に挿入し、針を下に押し付けます。画面の[実行]ボタンをクリックして、対応するキットに従ってプログラムを選択します。次に、[支援] を選択してすべての手順を確認します。
実行が開始されるまで[次へ]をクリックします。実行が完了するまでに約4.5時間かかります。プログラムが終了したら、[次へ] を選択します。
システムは10分間の遠心分離プロセスを開始します。遠心分離後、[蓋を開く]ボタンをクリックして、収集チューブをラックに移動します。手順が15分以内に次のステップに進まない場合は、最後のスピンを押して再遠心分離します。
収集チューブ内の上清を取り除き、チューブ内に100マイクロリットルの溶液を残します。残りのサンプルをピペッティングで混合し、OTとマークされた新しい1.5ミリリットルの遠沈管にサンプルを移します。上清をピペッティングするときは、側面に沿ってチューブの底に触れないでください。100マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水を各収集チューブにピペットで入れ、繰り返しピペッティングして洗浄したOTチューブに溶液を移す。
600マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をOTチューブに追加して、1ミリリットルの総容量を構成します。15, 500倍Gの遠心分離機で30秒間8分間ボルテックスします。OTチューブに100マイクロリットルの溶液を残して上清を静かに取り除きます。
チップを使用して、油層を完全に廃棄します。900マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、30秒間ボルテックスし、15, 500倍Gで8分間遠心分離します。20マイクロリットルの溶液が残るまで上清を取り除き、100マイクロリットルの容量を補うためにテンプレート再懸濁溶液を追加します。
その後、30秒間ボルテックスし、2秒間短時間遠心分離します。サンプル処理から12時間以内に次のステップに進みます 100マイクロリットルの希釈ライブラリ、130マイクロリットルのC1ビーズ、300マイクロリットルの3つのテンプレート洗浄液、および300マイクロリットルのメルトオフ溶液を8つのウェルストリップにロードします。エンリッチメントモジュールに8つのウェルストリップを取り付け、ピペッティングチップをロードし、200マイクロリットルの遠沈管を収集位置に設定します。
[開始]をクリックしてプログラムを実行します。55マイクロリットルの試料溶液をピペットで、チップのサンプル孔に注入する。チップを遠心分離機にセットします。
ノッチを外側に向け、サンプルポータルを内側に保ちます。次に、別の使用済みチップとのバランスを取り、10分間遠心分離します。テキスト原稿に記載されているように、ローディング溶液を準備します。
発泡溶液に100マイクロリットルの空気を吹き込みます。泡が密な発泡状態になるまで溶液を繰り返しピペットで固定し、泡の体積を約250マイクロリットルに保ちます。遠心分離後、チップをベンチに置きます。
100マイクロリットルの泡をサンプル穴に注入し、押し出された溶液をアウトポータルに取り出します。次に、チップを30秒間短時間遠心分離します。このプロセスを一度繰り返します。
50%洗浄バッファーで100マイクロリットルを2回注入し、注入のたびにアウトポータルの押し出し溶液を取り除きます。次に、50%アニーリングバッファーで100マイクロリットルを3回注入し、注入のたびにアウトポータルの押し出し溶液を除去します。気泡を避けて50%酵素反応バッファーに65マイクロリットルを注入し、アウトポータルの押し出し溶液を取り除きます。
ロードしたチップを室温で5分間安定させ、シーケンサーチップポータルにチップを取り付けます。計画済みプログラムを選択して情報を確認し、実行を開始します。代表的な実行では、合計17.6ギガバイトのデータが得られ、イオン球粒子の全体的な負荷率は、チップの全ウェルで88%でした。
ヒートマップは、チップの総面積に均一なサンプル負荷を確認しました。合計読み取りの77%が使用可能でした。ISPを負荷したすべてのウェルは、100%テンプレート濃縮を示し、78%がクローン性でした。
すべてのクローンテンプレートのうち、97%が最終ライブラリとして認定されました。リードの平均長は177塩基対で、中央値と最頻値はそれぞれ176塩基対と174塩基対でした。テンプレート中のチミン、シトシン、アデニンのピーク数は、適格なカットオフラインの50に対して約76でした。
ライブISPを備えたすべてのアドレス可能なウェルで、構築されたライブラリとして99.5%が認定され、ポリクローナルおよび低品質のライブラリの20%が除外され、ISPの76.6%がさらなる分析の資格を得ました。単一サンプルからのコピー数分散の結果は、4番染色体上のP 16.3からQ 35.2の182.16メガ塩基対モザイクトリソミーと、22番染色体上のQ 11.1からQ 13.33の33ポイント13メガ塩基対モノソミーセグメントを示した。フラグメント選択を実行する場合、ステップ間の時間間隔は、フロントエンドおよびリアエンドサンプルの過剰および曝露の欠如を防ぐために、同じバッチ内のサンプルのサイズに応じて変更する必要があります。
