このマウスの肝外胆管オルガノイドシステムは、前臨床胆管障害モデルへの限定的なアクセスと多能性幹細胞および肝臓由来胆管オルガノイドモデルの限界に対処することができる。当社のモデルは、成人組織固有、還元主義者、再現性、時間とコスト効率が高いモデルです。これは、人間の組織へのアクセスを持っていない研究所に特別な利益になります.

我々の技術は、組織再生および細胞間相互作用を研究するために、ほぼ無制限の数の肝外胆管胆管コリンギオサイトの培養を可能にする。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターである塩田純也です。肝内胆管分離の場合は、成体マウスをスピーヌ位置に置き、中線に沿って腹腔を開きます。

肝臓を引き込んで横隔膜に置き、止まり地を使用して近位十二指腸を優しく引っ張り、肝臓のヒラムのすぐ下に共通の胆管を明らかにする。メスを使用して、肝外胆管を周囲の組織から分離します。一般的な胆管の近位端を鉗子で保持し、十二指腸との分岐点のすぐ上に遠位で管を解剖してから、肝臓から管の近位端を解剖する。

分離した肝外胆管を氷上の冷たい洗浄バッファーを含むガラス板にすぐに入れ、周囲の組織から胆管を洗浄し、0.5ミリメートルの切片にミンチします。すべての組織をミンチした後、500マイクロリットルの解離バッファーを含むチューブに切片を移し、摂氏37度で20分間インキュベートします。解離の終わりに、500マイクロリットルの氷冷細胞培養培地で緩衝液を中和し、18ゲージ針を通して組織懸濁液を20回、20ゲージの針を通して20回トリチュレートする。

その後、得られた細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにフィルター処理します。胆道オルガノイド培養を確立するには、遠心分離によって細胞を収集し、上清を慎重に除去する。氷冷、滅菌PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、2番目の遠心分離のために1.5ミリリットルのチューブに細胞を移します。

洗浄したペレットを120マイクロリットルの液化、氷冷地下マトリックス、プレート40マイクロリットルの細胞を37度加温した24ウェルプレートの3つの井戸の中央に再懸濁し、37度の摂氏組織培養インキュベーターに約15分間プレートを置きます。地下マトリックスが固まったら、プレートをインキュベーターに戻す前に、各ウェルに37°Cの播種培地の600マイクロリットルを加えます。3日後、その後3日ごとに、600マイクロリットルの新鮮なオルガノイド培地で播種培地を交換し、逆顕微鏡でオルガノイドの成長を定期的にモニタリングする。

肝外胆管培養を通過するには、各井戸のオルガノイドを400マイクロリットルの氷冷PBSで10回ずつピペットしてから、ウェル内容物を個々の1.5ミリリットルチューブに移す。各混合物を25ゲージの針を4回通過させ、オルガノイドを解体し、遠心分離によって細胞を集める。次に、再めっきに適切な比率で基質マトリックス中の細胞を再懸濁します。

長期にわたる肝外胆管オルガノイド貯蔵のために、地下マトリックスの低下を妨げずに室温PBSでオルガノイドの各井戸を洗浄し、各井戸に500マイクロリットルの氷冷凍結培地を加える。オルガノイドを穏やかに再中断し、混合物を個々の極低温バイアルに移し、バイアルをマイナス80度で48時間置き、オルガノイドを窒素タンクに移して蒸気相で長期保存します。パラフィン埋め込み用のオルガノイドを準備するには、培地を摂氏4度の500マイクロリットルに置き換え、各ウェルから液化基質マトリックスを含む個々の1.5ミリリットルチューブに懸濁液を移します。

遠心分離によってオルガノイドを収集し、慎重にペレットを邪魔することなく上清を除去するために、修正されたP1000ピペットチップを使用しています。その後、氷冷の1ミリリットル、4%パラホルムアルデヒドをオルガノイドに加え、摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、固定剤を室温で5分間のインキュベーションのために室温PBSの1ミリリットルに置き換え、遠心分離によってオルガノイドを3回洗浄する。

最後の洗浄後、オルガノイドを30%エタノールの1ミリリットルで室温で5分間インキュベーションし、続いて室温で70%エタノールの1ミリリットルで5分間のインキュベーションを行います。70%エタノールインキュベーションの終わりに、遠心分離によってオルガノイドを収集し、室温で5分間100%エタノールの1ミリリットルでオルガノイドを再懸濁する。100%エタノールインキュベーションの終わりに、電子レンジで20秒間または液化するまで加熱検体処理ゲルを、オルガノイドの各チューブに50マイクロリットルの液化ゲルを加えた。

試料処理ゲルが固まるまでチューブを氷の上に置き、パラフィン埋め込み機でさらに処理するためにカセットの青いスポンジパッドの間に各チューブからオルガノイドの滴を移します。カセットを1ステップあたり15分間プログラムされた組織プロセッサに入れ、標準的なプロトコルに従って免疫組織化学的染色および分析のために、検体処理ゲル中のパラフィン埋め込まれたオルガノイドをセクションあたり4マイクロメートルで切り離します。肝外胆管オルガノイドめっきの効率は、新生児または成体マウスのいずれかから単離した場合、約2%である。

2回通過後、成体マウス由来の肝外胆管オルガノイドのめっき効率は11%に増加し、安定したままである。オルガノイドの大部分は、まれな不規則なオルガノイドを有するすべての箇所全体で嚢胞形態を示す。オルガノイドは5〜7日で成長ピークに達し、その後、内膜破片の蓄積を開始し、悪化する。

したがって、オルガノイド培養の維持のために、オルガノイドは7〜10日ごとに分割されるべきである。免疫蛍光で分析すると、肝外胆管オルガノイドは、E-カドヘリンによってマークされた上皮細胞の純粋な集団からなる。オルガノイド細胞はまた、胆道前駆細胞のマーカーと同様に胆道分化のマーカーを示す。

重要なことに、オルガノイド細胞の割合が高いのは、アセチル化アルファチューブリンによってマークされた一次シリウムを有し、これは正常な胆管球の特徴であり、適切なオルガノイド細胞分極化を示唆している。記載された温度条件への近い付着が必要である。細心の注意を払った胆管解離は膵臓細胞の汚染を防ぐ。

遠心分離後の慎重な操作により、細胞材料の損失を回避できます。これらのオルガノイドは、前臨床モデルとして使用することができ、遺伝的および薬理学的に操作され、または薬物および感染性薬剤の効果を試験するために使用される。この方法は、遺伝子組み換えマウスモデルを利用して、コリンギオライト生物学のメカニズムをさらに研究したいラボで使用することができます。