アイオワ州立大学の獣医診断研究所の職員、すなわちヘイリー・ランバート、エミリー・ラヘ、ロザリン・ブラナマン、ビクトリア・グリーン、ジェニファー・グロエルツ・ツグミのサンプルのタイムリーな処理に感謝の意を表したいと思います。また、透過性実験のための材料を提供してくれたJodi SmithとBethann Valentineにも感謝します。また、図 9 の協力をしてくれた David Diaz-Reganon にも感謝します。図6を除き、すべての図は BioRender.com で作成した。著者らは、Faculty Startup、ISU VPR Miller Award、ISU VPR Miller Award、NSF SBIR SubawardのISU # 1912948への支援に感謝したいと考えている。

K. Allenspachは、LifEngine Animal Health and 3D Health Solutionsの共同設立者です。彼女はCeva Animal Health、Bioiberica、LifeDiagnostics、Antech Diagnostics、Deerland Probiotics、Marsのコンサルタントを務めています。J.P. Mochelは、LifEngine Animal Health and 3D Health Solutionsの共同設立者であり、Ceva Animal HealthおよびEthos Animal Healthのコンサルタントを務めています。この記事は著者の見解を反映しており、食品医薬品局(FDA)の支持、見解、または方針を表すものと解釈されるべきではありません。他の著者は、宣言する利益相反を持っていません。

透過性支持装置における犬腸オルガノイド培養物は、従来の薬物透過性アッセイ40 を新規 なin vitro 犬モデル41と結びつけるユニークな概念である。さまざまな種類の犬腸オルガノイドを使用し、最小限の調整で実験の目的に基づいて評価することができます。1グループあたり3〜4ウェルで目的の薬物の複数の濃度を試験することが推奨される。濃度は、薬物の予想される腸内濃度に基づいてもよい。さらに、以前の研究を使用することは、研究デザインの適切な時点を決定するのに役立つ場合があります。再現性を高め、トラブルシューティングを支援するために、試験デザインの適切な文書化がなされるべきである。
この技術には、方法42の新規性のためにいくつかの制限があり、主に実験計画の標準化の欠如と実験室間でのプロトコルの実行によるものです。この標準化の欠如は他のグループ43によって認められており、犬の3Dオルガノイド単層プロトコルは実験室間の再現性につながり、このシステムに標準化を導入するでしょう。データ分析への標準化されたアプローチは、再現性を向上させ、異なる実験室にわたる透過性サポートシステムの犬オルガノイドを使用した予備薬物検査の結果を強化することができます。犬の3Dオルガノイドモデルには、Caco-2細胞44,45,46と同様に、モデル薬物のin vitro Pアプリ値を既知のヒトまたは犬のインビボ腸内吸収と比較するデータセットも欠けている。このようなデータが生成されると、この犬オルガノイドモデルは、医薬品開発中の腸透過性を評価するために利用され得る。
オルガノイドを透過性支持系に播種する際には、適切に解離した細胞の十分に高い密度を播種するように注意が払われることが重要です。システムのTEER値は、厳密な単層で成長させると、より信頼性が高く、再現性があります。単層の長期培養は、腸の生理学的値からさらに到達するTEER値の指数関数的な増加をもたらし得る。このような3D構造のH&Eセクションは、膜に近い腸細胞の構造が変化した状態で、細胞のいくつかの層が互いに重なっていることを示しています。
犬腸オルガノイド単層の拡張に成功した後、薬物の見かけの透過係数(Papp)式44を計算することによって、従来の2D細胞アッセイと同じ方法で結果を分析することができます。Pアプリ 値(Eq(2)参照)は、セルラー単分子膜47を横切る輸送速度を記述する。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
は<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;">、濃度と時間曲線の初期傾き(例:nmol/s)です。Aはインサートの面積(cm2)であり、C0はドナーチャンバ37内の薬物または化合物の初期濃度である。単層の完全性の信頼性の高い認識は、標準化を必要とする透過性アッセイの重要な部分です。透過性サポートシステム内のイヌオルガノイドを評価し、実験の正しいタイミングを決定するのに役立つように、光学顕微鏡およびTEER測定が推奨されます。さらに、ゼロ分子透過性マーカー(例えば、FITC−デキストラン、ルシファーイエロー、PEG−400)を使用して、オルガノイド単分子膜完全性を機能的に評価することができる。試験した化合物がトランスポーターの影響を受けている場合は注意が必要です。P-糖タンパク質(P-gp)は、一般的な排出ポンプ例として用いられる。周知のP-gpプローブ基板と比較して、流出比(Pアプリ、BL-AP/Pアプリ、AP-BL)を生成する必要があります。
光学顕微鏡(プレーンまたは位相コントラストで強化)は、細胞の過増殖の可能性を評価しながら、2Dまたは3D単分子膜とフィルターインサートの完全性をチェックするための非常に貴重な方法です。 図7は 、健康なイヌ腸管オルガノイド細胞培養物を認識するためのガイドとして役立つことができる。TEER値は、細胞間接合部の形成およびオルガノイド培養物の無傷の腸上皮への分化の重要な尺度である。犬の腸オルガノイドは腸細胞と杯細胞に分化する(図6)。これらの粘液産生細胞は、従来の2D細胞培養物を用いて達成することが困難であった薬物-粘液相互作用の研究を可能にする48。腸内分泌細胞の存在は、Chandraらによって犬腸オルガノイドにおいて以前に確認されている33。
TEMを用いた空腸、回腸、および結腸オルガノイドに由来する犬オルガノイド単層のさらなる特徴付けが提供される。TEM画像は、タイトジャンクションおよび微小絨毛形成を含む細胞マイクロアーキテクチャを示し、翻訳医療におけるこれらのオルガノイドモデルの複雑さおよび有用性をさらに示す。実験結果に基づいて、透過性支持体上のオルガノイド培養物は、播種後11日目から13日目の間に実験の準備が整った(図9)。この時点でのTEER値は1,500〜2,500Ω.cm2の範囲であった。TEER値のプラトー段階は、TEER値がゆっくりと低下し始める前に実験を開始する必要がある非常に限られた時間枠の間持続します。TEER値は、一部の薬物または医薬品賦形剤が単分子層(タイトジャンクションなど)と相互作用する可能性があるため、TEER値の読み出しに大きな影響を与える可能性があるため、重要な実験結果を表示する上で重要な部分でもあります。これだけでも、実験のデータとして使用できます。
デュアルチャンバー細胞培養装置における犬腸オルガノイドは、得られる細胞単層のユニークなアーキテクチャのために経口薬物透過性以外の分野に適用することができる。例えば、それらは、微生物学研究(例えば、GI微生物叢の変化の影響)、ウイルス取り込み研究、薬物−薬物相互作用、および薬物輸送機構において使用され得る49。ドナーチャンバは、典型的には、選択された試験薬物または化合物で満たされ、そして、レシーバチャンバからのアリコートは、様々な時点で採取される。これらのアリコートは、高速液体クロマトグラフィー、質量分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、またはその他の技術を使用して分析し、溶質が単分子膜を透過する量および速度を決定することができる。
これらの研究は、薬物透過性を正確に評価するために無傷の単分子膜を必要とする。これは通常、使用できない井戸を説明するために必要なものを超えて単層を成長させる必要があります。オルガノイド細胞単層はまた、ウイルスの細胞取り込みを検出するための抗体を利用する免疫蛍光アッセイを含む読み出しを用いて、単層の頂端側または基底側のいずれかからウイルスの取り込みを測定するために使用され得る。最後に、複数の薬物(すなわち、基質および阻害剤)をドナーチャンバーに適用して、トランスポーターベースの薬物−薬物相互作用を同定することができる。
現在の観察に基づいて、これらの方法は、培養インサート中のイヌオルガノイドに適用できるだけでなく、他の獣医種および器官系にも適しており、選択した種または器官モデルに最も適したわずかな修正が必要である。犬腸オルガノイド増殖のためのプロトコルは、培養物のユニークな特性に基づいて調整されなければならなかった。したがって、プロトコルは別の種に調整することができますが、プロトコルに微妙な変更が必要になります。改変は、細胞播種密度の変化から始まり、目的のオルガノイドを適切に分化するための培地組成物の変化に拡大し得る。
標準化、実験手順の詳細な文書化、および細胞単層の一貫したモニタリングは、透過性サポートアッセイ全体で必要な重要なプラクティスであり、犬系に限定されません。これらの可能な種または器官の改変は、この分野におけるさらなる進歩のために文書化および報告するために重要である。このモデルには、いくつかの制限、例えば、そのコスト要件、実験室間の変動性、および インビボでの腸内吸収を予測する能力に関する限られたデータがある。イヌは、場合によっては、ヒト50とは異なる薬物トランスポーターおよび代謝酵素を有する。
さらに、犬オルガノイド系は、そのようなモデルの適合性を決定するために、他の製造業者からの様々な他のデュアルチャンバー装置上で試験されなければならない(例えば、異なるフィルター膜組成物の適合性を決定しなければならない)。もう1つの欠点は、原稿の薬物透過性実験の部分が前の部分よりも説明的ではないことです。これは、このフィールドの過剰な情報が原因です。原稿のこの部分の目標は、これらの実験の礎石の端を切らずに、これらの方法を修正可能な方法で記述することでした。透過性実験に関するより詳細な情報は、Hubatschらによって収集されている37。さらに、透過性インサートは、共培養、細胞遊走、および浸潤アッセイ実験4において使用することができる。
結論として、デュアルチャンバー培養装置における犬腸オルガノイドは、生物医学分野やトランスレーショナル医療など、幅広い用途に使用される可能性を秘めています。このプロトコルは、実験を計画し、生物学の分野にわたるオルガノイドモデルの実験室間データの信頼性を促進するためのいくつかの戦略を作成します。

透過性支持システムは、典型的には、腸上皮障壁1,2を通る治療薬候補の見かけの透過性を決定するために使用される。また、細胞分泌3、細胞遊走4、および薬物毒性5を評価するためにも使用することができる。インビトロ経口薬物透過性アッセイは、創薬および開発プロセス2における重要なステップであり、個々の薬物候補は薬物R&Dライフサイクルの初期段階でテストされています6。この透過性支持システムは、マルチウェルプレートに入れられた半多孔膜を備えたインサートからなるデュアルチャンバー細胞培養装置である。このシステムは、インサート7で増殖した細胞単層の頂端側および底辺側への直接アクセスを可能にする。これらの系で使用される単層は、典型的には、胃腸上皮細胞(例えば、ヒト結腸直腸腺癌Caco−2細胞株)に由来する8。細胞培養物は、腸上皮細胞の自然なマイクロアーキテクチャを模倣した分極状態で増殖し、さらなる細胞分化、同様のミクロ解剖学および機能を可能にする7。透水性サポートインサートの詳細については、図1を参照してください。インサートの2D細胞培養物による播種は、伝統的に腸管薬物透過性を評価するために使用され、比較的手頃な価格で培養が容易である9。これらの系は、治療薬候補10、11の腸内代謝を予測する能力が限られていることを含む、いくつかの主要な限界を提示する。これは、上皮細胞間のタイトジャンクションを通る受動的吸収、流出による能動的な経皮吸収、または取り込みトランスポーター(例えば、P-糖タンパク質、モノカルボキシレートトランスポーター1)、および腸細胞によって代謝される薬物など、薬物吸収のすべてのメカニズムに当てはまる。
犬は人間と共通の環境と食事を共有しています12.犬の腸の解剖学とマイクロバイオームの組成は、過去36,000年にわたる家畜化と共有食に起因するとされてきたヒト13の組成によく似ています14。残念なことに、これらの類似性は、疾患発症の一般的な原因/引き金にもなり得る。イヌは、肥満15、炎症性腸疾患16、結腸直腸腺癌17、胃腸間質腫瘍(GIST)18、およびそれらの相対的長寿に関連する様々な他の病状19など、ヒトと同様の慢性罹患率を発症する。したがって、イヌオルガノイドは、One Health Initiative20の精神において、これらの慢性多因子疾患の逆トランスレーショナル研究に首尾よく使用される可能性がある。
Caco−2細胞は、薬物経口吸収アッセイ21に最も使用される細胞株である。これらの細胞は現在、インビトロ腸透過性アッセイのための「ゴールドスタンダード」モデルと考えられている2、22、23。Caco-2細胞株は、異なる発現レベルであるが、ヒト腸管に見られる流出および取り込みトランスポーターを発現する24、25、26。Caco−2細胞はまた、薬物が腸流出トランスポーターの基質または阻害剤であるかどうかを決定するためのモデルとしても広く使用されている22、27。Caco-2細胞は結腸起源であるが、腸細胞を模倣する。残念なことに、Caco−2細胞は、小腸9の上皮層からの1つの細胞型のみを表しており、複雑な腸上皮細胞型組成物を正確に再現することができない。例えば、粘液産生専用の杯細胞はCaco−2培養物から欠如しており、粘液−薬物相互作用は他の細胞株28との共培養なしには評価できない。さらに、Caco−2培養物は、プレグナンX受容体(PXR)、ステロイドX受容体(SXR)、および構成的アンドロスタン受容体(CAR)29など、腸内に典型的に存在する重要な核内受容体のいくつかを発現しない29。その結果、Caco-2培養物は、これらの受容体の誘導因子である特定の薬物(例えば、リファンピン)による薬物輸送体および酵素の誘導をモデル化できない30。
3D腸オルガノイド技術は、これらの制限のいくつかに対処します19。オルガノイドは、成体幹細胞に由来する自己組織化構築物であり、マイクロ侵襲的技術を用いて採取された組織サンプルから樹立することができる20。ヒト誘導多能性幹細胞は、腸透過性モデル31、32に採用されている。イヌオルガノイドは、ヒト幹細胞研究が倫理的問題によって制限されているため、ヒトオルガノイドに関連する代替手段を提供する33。さらに、犬オルガノイドは、犬の薬物透過性、代謝、能動輸送、および薬物-薬物相互作用を探索するための in vitro システムを提供する。この技術ギャップに対処するために、透過性支持系における犬腸オルガノイドの一貫したかつ確実な成長が記載されている34。犬腸オルガノイドを用いた透過性アッセイは、現在使用されているアッセイ(Caco-2)と比較して、犬腸透過性および低分子薬物分子の代謝を潜在的に予測する可能性がある。これらの極めて重要な特徴の確認は、この新規 なin vitro システムを、細胞内代謝および能動的輸送に対する誘導物質の潜在的な影響を探求する将来の研究に役立てる。
イヌオルガノイドは、腸の上皮層に典型的に存在する全ての細胞型から構成される。機能的および微小解剖学的観点から、それらは犬腸の上皮層の環境を確実に複製する19,35。さらに、粘液、犬特異的薬物トランスポーターおよび酵素の存在、ならびに犬腸オルガノイドにおける全体的な細胞分化は、イヌにおいてインビボで見られるものに匹敵する34。したがって、オルガノイドは、罹患した獣医患者から単離され、犬の経口薬物透過性に対する様々な疾患プロセス(例えば、慢性腸の炎症)の効果をモデル化するために使用することができる19、36。犬腸オルガノイド系は、薬物透過性実験以外の設定でも使用することができる。これらの3D構造はまた、炎症性腸疾患、結腸直腸腺癌、および胃腸間質腫瘍についてChandraらによって以前に記載されたように、罹患患者から単離することもできる19。
透過性サポート播種プロトコルは、インサート中に犬腸オルガノイド培養物を確立するための方法を記載している。この第1のプロトコールは、細胞外膜マトリックスに播種された確立されたイヌオルガノイド培養物を解離させる方法を概説する。さらに、コラーゲンIおよび細胞外膜マトリックスによるインサートのプレコーティングは、このプロトコールにおいて議論される。犬オルガノイドを透過性支持体インサートに埋め込むことも詳細に説明される。
2番目のプロトコルは単層維持プロトコルで、インサートにメッキされた犬の3Dオルガノイドの一般的な維持管理が含まれています。培養物をリフレッシュするために使用されるオルガノイド培地の頻度および体積、ならびに細胞培養の損傷を防止する方法を、上皮単層のコンフルエンシーを評価するための実験方法とともに、この第2のプロトコールに提示する。
最後に、透過性実験プロトコルは、透過性アッセイにおける犬腸3Dオルガノイドが実験的使用の準備ができているかどうかを判断する方法と、実験を実施する前に必要な検証手順に焦点を当てています。このセクションでは、透過性実験のセットアップと成功裏の実行、ならびに単層培養のチャンバー内での治療薬候補のインキュベーションとサンプリングについても説明します。単層の完全性を監視するための低透過性フルオレセインイソチオシアネート(FITC−デキストラン)の使用も議論される。最後に、実験終了後の結果を検証するための インビトロ 評価方法について説明する。透磁率実験は非常に広大なトピックであり、Hubatschらによって非常によく要約されています。プロトコルのワークフローを 図 2 にまとめます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> 図1:透過性サポートシステム上の犬腸オルガノイド。 透過性サポートインサートは、24ウェルプレートのウェルに配置される。微多孔性膜は、解離したイヌ腸オルガノイドの播種を可能にし、これらの細胞は最終的にオルガノイド2D単分子層を形成する。この技術により、単層の AP 側と BL 側の両方にアクセスできます。オルガノイド培地は、透過性支持体のAPチャンバーおよびBLチャンバーの両方に導入される。薬物候補の吸収(AP→BL)および分泌(BL→AP)ならびに薬物輸送の2つの可能な様式が例示される。略語: AP = 頂端;BL = 側底側。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> 図2:犬用オルガノイド透過性サポートプロトコルのワークフロー。 透過性支持体インサートを細胞外膜マトリックスとコラーゲンIとの混合物でプレコーティングし、1時間インキュベートした。インキュベーションプロセスの間、オルガノイド培養物は解離する。個々のオルガノイド細胞はインサートに播種され、播種直後に基底チャンバー内の培地が添加され、一方、頂端チャンバーに培地が播種プロセスが終了してから24時間後に添加される。オルガノイドの維持とモニタリングには、定期的な培地交換、TEER値測定、および単層の完全性を評価するための光学顕微鏡検査が含まれます。実験の前に、オルガノイドは、培地からROCK阻害剤およびGSKiβを除去することによって分化されなければならない。TEER値は実験当日に測定され、オルガノイド単層は光学顕微鏡で細胞への損傷がないか検査されます。次いで、培地を適切な緩衝液と交換し、実験前にインキュベートする。FITC−デキストランアッセイは、単層完全性のマーカーとして腸透過性実験39 の間に使用される。TEER測定は実験後に行われ、光学顕微鏡は24時間後に結果を検証します。略語:TEER =経上皮電気抵抗;ROCK = rho関連キナーゼ;GSKiβ=グリコーゲン合成酵素キナーゼβ;F = 蛍光。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

透過性サポートシステムは、通常、新しい治療薬候補の経口透過性を評価するための in vitro ツールとして、従来の2次元(2D)細胞株と組み合わせて使用されます。しかしながら、これらの従来の細胞株の使用には、タイトジャンクションの発現の変化、部分的な細胞分化、および重要な核内受容体の欠如などの制限がある。これらの欠点にもかかわらず、Caco-2およびMDCKモデルは広く受け入れられており、ヒト のインビボ 経口透過性の予測のために検証されています。
イヌは、胃腸解剖学および腸内微生物叢とヒトとの類似性のために、生物医学研究に関連するトランスレーショナルモデルである。したがって、並行医薬品開発を支援するために、イヌおよびヒトの両方 におけるインビボ 薬物透過性特性を予測するための効率的かつ正確な インビ トロツールの精緻化が非常に望まれる。このようなツールは、イヌ腸オルガノイド系であり得、成体幹細胞に由来する三次元(3D)自己組織化上皮構造によって特徴付けられる。
(1)透過性支持体播種プロトコルは、インサート中のイヌオルガノイドを解離および播種するための実験方法を記載している。犬のオルガノイドの単離、培養、および収穫は、この特集号の別のプロトコルセットで以前に説明されています。犬腸オルガノイド単層の一般的な維持のための方法は、(2)単層維持プロトコルにおいて徹底的に議論されている。さらに、このプロトコルは、経上皮電気抵抗(TEER)測定および光学顕微鏡検査を介して単分子膜の構造的完全性を評価する方法を記載している。最後に、(3)透過性実験プロトコールは、実験結果の インビトロ 検証を含む、実験の直前のタスクを記述している。
全体として、犬オルガノイドモデルは、デュアルチャンバー細胞培養技術と組み合わせることで、2D実験モデルに関連する制限を克服し、それによって、犬およびヒト患者の両方における治療薬候補の見かけの経口透過性の予測の信頼性が向上する。

犬オルガノイドの培養のための標準的な操作手順は以前に記載されており33、犬オルガノイドプロトコルもこの特別号38で詳細に議論されている。透過性支持体上で培養した犬腸オルガノイドを固定し、パラフィン包埋し、単層および細胞集団のミクロ解剖学を調べた。パラフィン包埋プロセスは、以前にGabrielらによって議論された38。日常的な染色(ヘマトキシリンおよびエオジン)が行われており、アルシアンブルー染色技術を使用して、犬のオルガノイド単層中の杯細胞を検出しました( 図7参照)。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> 図7:犬腸オルガノイド単層染色。透水性支持体中の結腸起源の犬腸オルガノイドは、パラフィン包埋され、H&EおよびABで染色されている。H&E染色は柱状上皮単層を明らかにし、細胞の頂端部分の微小絨毛を60倍の倍率で観察することができる。AB染色はさらに、犬腸オルガノイド単層における杯細胞(濃い青色)の存在を明らかにする。スケールバー = 20 μm (A), 50 μm (B).略語:H&E =ヘマトキシリンおよびエオジン;AB = アルシアンブルー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
透過性支持体上のオルガノイド培養物を、透過性実験の準備をするために10〜14日間増殖させるべきである。光学顕微鏡は、薬物候補の透過性試験のためのオルガノイド培養の準備を確認するために、TEER値測定と組み合わせて使用される。健常動物および罹患動物からの異なる犬腸オルガノイド単層の代表的な光顕微鏡画像を 図8に提示する。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> 図8:犬腸内オルガノイド単層顕微鏡。光学顕微鏡で見た成長単層の画像。健康なドナーに由来するオルガノイド単層は、空腸腸(10x;40x)およびコロノイド(20x;40x)培養によって表される。罹患ドナーのオルガノイド単層は、PLEと診断されたイヌ患者に由来する十二指腸(5x;10x)および回腸(5x;10x)エンテロイドによって表される。PLEオルガノイド培養物はいずれも、オルガノイドの播種中の不適切な細胞単離の例であり、これらの培養物は3Dオルガノイドの存在のために薬物透過性アッセイに使用することができなかった。単層涙(5倍)などの適切な単層形成からの逸脱の例は、生物学的サンプルの慎重な操作によって引き起こされます。オルガノイドの長期培養(10倍、20倍)は、オルガノイドが元の3D構造に似始めたときに、オルガノイドがインサート上に長時間維持されることによって引き起こされます。比較のために、薬物透過性研究に一般的に使用される透過性支持体上の従来の2D細胞株の画像を提示する(MDCK-10x;40x、およびCaco-2-10x;20x)。略語: PLE = タンパク質喪失腸症;MDCK = マディン・ダービー犬腎臓。スケールバー = 500 μm (5x)、200 μm (10x)、100 μm (20x)、50 μm (40x)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
オルガノイド単層はまた、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の3%パラホルムアルデヒド−3%グルタルアルデヒド中で固定した。透過型電子顕微鏡(TEM)は、透過性支持体上のオルガノイド培養物の超構造を特徴付けるために使用した。微小絨毛およびタイトジャンクションの微小解剖学的構造は、図9に見ることができる。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> 図9:健康な犬腸オルガノイド単層のTEM画像。 TEMを用いて、空腸(A)、回腸(B)、および結腸(C)オルガノイド単層の細胞マイクロアーキテクチャを明らかにした。透過性支持体インサートの微多孔膜は黄色の矢印でマークされている。微小絨毛(青色矢印)およびタイトジャンクション(赤色矢印)の存在が画像に描かれている。略語:TEM=透過型電子顕微鏡。スケールバー = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
TEER測定と光学顕微鏡の両方を実行して、システムが透過性試験の準備ができていることを確認する必要があります。このアッセイは、TEERが定常状態に達するとすぐに使用できますが、光学顕微鏡はオルガノイドの損傷または過増殖を排除するのに役立ちます。犬空腸腸およびコロノイドからなる5つの群の典型的なTEER測定値の要約を 図6に提示する。
表1:オルガノイド培地およびFAAの組成。 CMGF+、CMGF+ R/G、およびFAAの完全な組成をこの表にまとめます。略語:ROCK = rho関連キナーゼ;GSKiβ=グリコーゲン合成酵素キナーゼβ;CMGF + R/G = ROCK阻害剤およびGSKiβで強化された成長因子を含む完全培地;CMGF+ = 成長因子を含むが、ROCK阻害剤またはGSKiβを含まない完全培地;FAA = ホルマリン - 酢酸 - アルコール;EGF =上皮成長因子。この表は 38から適応されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:透水性支持系をイヌオルガノイドにメモを取るための表。 略語:TEER =経上皮電気抵抗;ROCK = rho関連キナーゼ;GSKiβ=グリコーゲン合成酵素キナーゼβ;CMGF + R/G = ROCK阻害剤およびGSKiβで強化された成長因子を含む完全培地;CMGF+ = 成長因子を含むが、ROCK阻害剤またはGSKiβを含まない完全培地。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

ここでは、デュアルチャンバー透過性サポートシステムにおけるイヌ腸オルガノイドの培養を記述するプロトコルを提示する。透過性支持体におけるオルガノイド播種、単層維持、およびその後の薬物透過性実験が記載されている。

デュアルチャンバー透過性サポートシステム内の犬腸オルガノイド

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K ビュー.  Iowa State University. ここでは、デュアルチャンバー透過性サポートシステムにおけるイヌ腸オルガノイドの培養を記述するプロトコルを提示する。透過性支持体におけるオルガノイド播種、単層維持、およびその後の薬物透過性実験が記載されている。

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Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

のための負の選択マーカーの開発赤痢アメーバ</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

免疫・感染学

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

サルモネラおよび他の病原体に対する上皮細胞保護を研究・修飾するためのヒト誘導多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの使用

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...