The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.

文化メディアと皿の調製<ol><li>ビガーズウィッテンとウィッテン（BWW）5.54グラムのNaClを添加することにより17作業溶液、0.356グラムのKCl 0.25グラムのCaCl 2、0.162グラムのH 2 KO 4 P、およびミリQ水1Lに0.294グラムのMgSO 4を200ml作る。これは、原液である、月まで4℃で保持することができる。 </li><li>ストック溶液から、飽和NaHCO 3 420mgの追加- BWWストック193 mlに、200 mgのグルコース、6mgのピルビン酸ナトリウム、600mgのウシ血清アルブミン、0.74ミリリットル乳酸ナトリウム、およびHEPES緩衝液4.0 mlで。これは実用的なソリューションであり、常に日に新しく作られ、使用する前に、37℃に平衡化する。 </li><li>カニューレを作るために、チューブが溶け出すこと（通常はメタノールの炎）などを0.4ミリメートルの内径1.1mmの外径とのポリエチレン（PE）管材を取り、弱火で開催しています。すぐにチューブを引っ張るOUTWARDは、ストレッチと外径が狭く作る。 </li><li>輸精管をより簡単にカニュレーションを可能にし、一端の狭窄を生成するためにカット。 </li><li>約15cmのカニューレのもう一方の端をカットします。平滑末端に30 G針を挿入し、（完全に後退）をそれに3ミリリットル注射器を取り付けます。 </li><li> PEチューブ（4.2g内径、6.4ミリメートル、外径）の長さ20cmに切断し、吸引口金を行う。一端にマウスピースを挿入します。 </li><li>マイクロキャピラリーガラス管ホルダーとガラスマイクロキャピラリー自体（マウス用典型的には3μL、ラットのために40μl）を挿入します。 </li></ol>マウスから精巣上体の2の除去<ol><li>各機関への具体的なIACUCが承認した手順に従ってマウスを安楽死させる。 </li><li>動物を取り、精巣上体を露出するように陰嚢に小さな切開を作る。時計師の＃5鉗子のペアを使用して空洞の外に精巣と精巣上体を引き出します。 </li><li>そのようなことを少なくとも1〜2 CMは精巣上体尾に取り付けられたまま輸精管をカット。また、精巣に精巣上体を接続する近遠心性ダクトと組織を切断し、全体の男性の生殖トラックを削除します。 </li><li> 5-40Xの順に倍率範囲で解剖顕微鏡下で全体の男性の生殖トラックを配置します。 </li></ol> 3.精巣上体カニューレを挿入<ol><li>狭め（円錐状）のエンド1-2 CMがレンズを通して自由と見えるよう顕微鏡にカニューレ、ダウンテープ。 </li><li>時計師の＃5ピンセットを取り、優しく輸精管の各側面を握るとカニューレは輸精管に入るように、カニューレ上に輸精管を引っ張る。 </li><li>非吸収性黒編み扱わ絹（サイズ5-0）の長さを取り、カニューレを挿入輸精管の周りに結び目を作る。確実に結び目が輸精管の内側カニューレを保持するためにきつく引っ張られたときに空気圧frとオム注射器が適用される。 </li></ol> 4.逆行または尾精巣上体精子のバックフラッシュ<ol><li>時計職人の＃5鉗子を使用して、精巣上体尾部の先端部をつかみ、単一の精巣上体細管を露出させるために、白膜を除去します。 </li><li>鉗子を使用して、静かに公開し、その後リリースされる精子のための開口部を作成するために、離れていじめる細管を引き出します。 </li><li>輸精管に注射器から空気を排出するようにゆっくりと3ミリリットル（マウス）または20ミリリットル（ラット）を注射器で押してください。適切な圧力では、精子がゆっくり精巣上体尾の先端に壊れた尿細管から出てくるし始めます。このとき、ガラスキャピラリーに精子を描画するためにマウスピースに吸引を適用する。注意：通常のマウスに、精子の2-3μlの動物の年齢に応じて得ることができる。ラットの意志、平均収量30〜40μlの上。 </li></ol> 5.洗濯とプロテオミクスのための準備に精子を溶解<ol><li>毛細管から背面精子を押圧するように穏やかにマウスピースに吹き込むまたはシリンジを取り付け、空気を排出することにより、BWW溶液（37℃）、1mlの溶液中にガラスキャピラリーから精子を放出する。 </li><li>精子細胞が拡散された後、夾雑タンパク質を除去し1mlのBWWで3回（300×gで、5分間）洗浄する。最終洗浄後、上清を除去。注：この時点で、精子細胞は、後で使用するために凍結することができる。 </li><li>間欠的にボルテックスしながら1時間、4％CHAPS、2 M尿素、50 mMトリス、pHが7.4を使用してタンパク質を可溶化する。 </li><li>細胞を溶解した後、遠心分離（10,000×gで、20分）、新しいチューブに上清と転送を取る。注：この時点で、タンパク質の定量を行うことができる。 </li></ol> 6.ジスルフィド結合還元およびアルキル化<ol><li>溶解したタンパク質に最終濃度として10 mMのDTTを追加し、vortexは、30分間、室温でインキュベートする。 </li><li> 50 mMのを追加し、溶解液に最終濃度としてidodoacetamide渦、暗所で室温で30分間インキュベートする。 </li></ol> 7.降水<ol><li>メタノールクロロホルムは、溶解物の1の体積（例として400μl）を添加することにより、サンプルを沈殿させ、メタノール1容量（400μl）を加え、0.5容量（200μl）をクロロホルム。 </li><li>ボルテックスサンプルとスピン（10,000×gで、2分）。 </li><li>二相が遠心分離後に表示されますので注意してください。すべてが、トップ層（界面を乱さないように注意しながら）の2ミリメートルを捨てる。 </li><li>メタノールの1容量（400μL）、反転チューブは穏やかに混合し、再びスピンする1-2x追加（10,000×gで、15分）。 3-4分間乾燥したペレットを無駄にし、空気に上清を捨てる。 </li></ol> 8.トリプシン消化<ol><li> （W / W;タンパク質：トリプシン）1：50の比を1 M尿素を含む25 mM重炭酸アンモニウム中でトリプシンを再構成し、オベインキュベート好ましくはサーモミキサー上で700rpmで37℃でrnight。 </li><li>未消化物質をペレット化するためのスピン（10,000×gで、15分）。上清を新しいチューブに移す。 </li></ol> 9.リン酸化ペプチドの濃縮<ol><li>以前に18を説明したようにトリプシン消化物からリン酸化ペプチドの精製および濃縮を行ってください。 DHBバッファー中でトリプシンペプチドを10倍に希釈する[DHBバッファの構成：350 mg / mlの2,5- dihydrobenzesulfonic酸（DHB）、80％（v / v）のACN（アセトニトリル）、2％（v / v）のTFA（トリフルオロ酢酸酸）]とTiO 2ビーズ（200μgの）を乾燥させるために適用されます。 </li><li> 1時間室温で回転装置上にしておきます。 </li><li> 、DHBバッファーでサンプルを洗浄し、スピンし、上清を除去します。その後DHBを除去するために[80％ACN（v / v）を、2％TFA（v / v）で]、洗浄緩衝液で試料を3回洗浄する。 </li><li>最後の回転の後、直接に2.5％水酸化アンモニウム、pHが≥10.5溶液25μlを添加することにより溶出緩衝液を用いてリン酸化ペプチドを溶出させる。 Sピンと上清を除去。すぐに〜0.3μlのギ酸で中和する。 </li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+isotopic+labeling+and+mass+spectrometry+to+analyze+capacitation-associated+changes+in+the+phosphorylation+status+of+mouse+sperm+proteins.">Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins.</a> J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

精子の成功と再現性のプロテオーム解析のための重要なステップは次のとおりです。出発物質の1）純度。 2）不要な塩および界面活性剤の除去;トリプシンはタンパク質の高収量を消化することを可能にするように、3）その最大限にタンパク質を変性し、4）ペプチドの損失を低減するためにサンプル処理を最小限に抑える。 成功した精巣上体尾をバックフラッシュするためには、精子が終了し、そこから領域を見つけることが不可欠である。ラットおよびマウスの両方の場合、これは、精巣上体尾部領域の中央部（ 図2A参照 ）、凹面領域の頂点である。一つは輸精管に向かってさらに付属している場合、バックフラッシュは簡単で、成功率は一般的に高いです。しかし、これは精子数の損失に来る。一つはコーパスより近位に移動しようとした場合あるいは、その後圧力の量はepididym通って精子を押し出すために必要アルダクトは、精巣上体への損傷が必然的に発生していると、しばしば非常に高いです。 精巣上体のバックフラッシュは、伝統的に精子22-25を除去するための媒体として、注射器自体に水飽和鉱油及び平衡塩溶液を用いて行われる。両方の手順は、LC-MSの潜在的に問題である。第一に、ミネラルは、そのどれもが手順に持ち越されないように注意する必要があり、基本的プロテオーム解析とケアのための世界中で使用されているナノC18ナノの列をブロックする可能性がある。これが発生した場合は、継続することは不可能であり、サンプルは、本質的に失われる。これは、これが成功したものの、我々はすぐにBWW液が接触したとすぐに精子の多くは、運動性になることを認識し、尾精巣上体と混合し、しかしBWWまたはシリンジ内の他の平衡塩類溶液を使用することによって克服することができる細胞。この問題を回避するために、我々は単に空気と精子をバックフラッシュ。だけでなく、QUALです液体ベースの方法に匹敵する精子のITYが、量は同じである。 Phosphoproteomicsは、おそらくシグナル伝達経路は、精子のポスト射精で発生している確立するための唯一の方法の一つです。私たちが調査している主要な経路の一つは、受精能のプロセスです。それが卵に結合することができる前に精子が「能」を受けなければならない。実際には、これは、一定の期間精子をインキュベートすることによって基本的に達成される（マウス40分、1.5時間、ラット;ヒト3-24時間）血清アルブミンBWW溶液に。以前、我々は、他の受精能に関与するいくつかのキナーゼの役割を示している。興味深いのは、精子を試験管内で自然発生的に泳ぐが、過剰活性26を受けることができないPKAμII農産物マウスの削除。後者は、精子が低いと、高速、低振幅から自分の遊泳パターンを変更することにより、受精能の特徴である速度、高振幅、周波数を破った。我々は、このプロセスに関与する下流のキナーゼのpp60-CSRC（SRC）を含んで示されている13,27のc-はい28およびc-ABL 14。興味深いことに、SRCの阻害は能依存チロシンリン酸化13を停止します。しかし、これは、SRCを直接チロシンリン酸化29の一般的な発症に関与していないが、ホスファターゼ29を調節し得ることを示唆し、オカダ酸を克服することができる。精巣上体から精子を強制的に媒体としてBWWを使用する際の問題は、一旦活性化され、マウスの精子のみcapacitateに約40分かかるである。精子の単離は5分/マウスをとることができ、多くの場合、いくつかのマウスを実験に使用されていることを考慮すると、精子は、実験の開始時に成熟の異なる段階であろう。これを克服するために、空気圧がガラスカニューレに尾精巣上体の精子をプッシュするために使用することができる。だけでなく、すべての精子INACTですアイブと本質的にそれらが尾環境に見られるように、それは、非運動性と運動性phosphoproteomicsを比較することが可能となる。 二つの異なる機能状態で精子を比較するときphosphoproteomicsためのサンプル処理は最小限に保たれるべきである。タンパク質沈殿1）の他の従来の方法を超えるメタノールクロロホルムの使用は、2）塩および脂肪のほとんどすべての痕跡を除去し、3）TCA 19を介して少量のタンパク質を沈殿させるための実証済みの能力を有する、余分な洗浄工程の必要性を減少させる。 （トリプシン消化を助ける）、タンパク質を変性させるためにこのヘルプを行いますが、細胞内に存在するMS-互換性の代謝物の多くが削除されていないだけので、事前のトリプシン消化に対するタンパク質沈殿をお勧めします。 精子ホスホペプチドの比較は多くの方法で行うことができる。別のものと基本的なレベル、1サンプル中の特定されリン酸化ペプチドの単純な比較、時「スペクトルカウント」として知られるプロセスでサンプルを行うことができる。初期のプロテオミクス研究は低いの複製を使用していたので批判は基本的に、このアプローチにされている（充実した議論のためLundren ら 30を参照）。より洗練されたアプローチは、ペプチド、親質量の強度を見て、他のサンプル（ラベルのない比較）でこれを比較することである。 図4に示す例では、m / zが650〜から非運動性から（ 図4の上面）には存在しないが、運動中に存在するペプチド（ 図4下）精子を見ることができる。 MSに基づくラベルフリー定量化とも呼ばれるこのプロセスは、無標識戦略である。 一般的プロテオミクス定量化するために必要な実験の量を減少させるために使用される代替の戦略は、同位体を使用することである。同位体の質量が異なるように、質量分析計はELUTの強度を比較することができるるペプチド。しかし、ほとんどの他の細胞型とは異なり、いくつかの同位体標識は、精子には適用できない。例えば、安定同位体（軽量版が他に追加されながらつの重同位体は、一つのサンプルに追加される）の添加は、組織培養に用いることができる。同位体は、タンパク質に組み込まれ始めるとき、プロテオミクス分析は、2つのサンプル（多重化）を組み合わせることにより行うことができる。しかし、精子の場合には、これは）は、単に1）同位体標識は、組織培養および2）8まで（いくつかの通路を必要とするという事実によって、行うことができない精子細胞は、全く核遺伝子の転写および翻訳を持たず、従って彼らはとにかくすべてのタンパク質に同位体を組み込むことができません。これを回避する一つの方法は、しかし、これらは悪名高く高価で、放射性標識したマウスを注文することです。別のアプローチは、化学タグを使用することである。非受精能マウスは受精能のマウスと比較したときに行われている。この場合、D 0およびDで<sub&gt; 3 -labelは、質量分析計31における一つのサンプルと他とを区別するために使用された。他のアプローチは、リシンが異なる質量同位体と化学的に標識されていることにより、例えばiTRAQ（相対的および絶対的定量のための同重体タグ）の使用を含むことができる。 ICAT（同位体コード親和性タグ）システインが異なる質量同位体および重および軽水のラベルで標識される。 それぞれ、すべての場合において、しかし、一つのことを念頭に置いておく必要がある。 MSは唯一の試料中に存在するものを報告し、これは、その時点までそのサンプルに起こったすべてのものを反映している。各ステップでの収率を最大にしながら、試料の取り扱いを最小限に抑えることが成功したプロテオーム解析のために必要である。

精巣から現れた、精子がまだ非常に顕著に区別され、これらの細胞は、1,2-未熟である。そのようなものとして、それらは泳ぐ卵母3に結合する能力を含む完全な機能性を欠いている。精子細胞のさらなる成熟が必要であるが、それらの細胞分化過程のこの段階で、それらは、遺伝子転写、さらにタンパク質生合成4ことができないので、これは、標準的な経路を介して起こることができない。彼らは精巣を離れて、精巣上体5として知られる男性生殖器系の一部を入力するなどの生物学的能力は、精子に付与されている。精巣上体は、輸精管に（精巣の）遠心性ダクトを接続し、すべての男性の哺乳類6に存在しているしっかりとコイル状、高度に差別化された管である。精子は徐々にCRで刻々と変化する管腔環境に依存して、精巣上体の降下中に彼らの受精の可能性を獲得地元の精巣上体上皮細胞7によってeated。精巣上体環境の行為に存在する様々な分泌および再吸収性の活動はそのタンパク質、炭水化物と脂質組成物6を変え、精子自体を変更します。精巣上体の重要性、特にこの構造体の初期の「頭」領域は、外科的なライゲーション技術8を用いて例示されている。輸出管結紮によって、精巣内に保持精子が完全に卵母細胞9-11を受精するためにどんな能力に欠けている。 精巣上体の環境に加えて、精子の作業内シグナル伝達経路は、翻訳ポスト既存の精子細胞の補体を変更する。例えば、精巣上体の初期領域からの精子は、これらの後者の地域5,12に比べてタンパク質リン酸化の異なるパターンを表示する。 C言語で広大な違いがあるので、これは驚くべきことではないこれらの地域からの精子のapability。たとえば、初期の、頭の精巣上体から精子がimmotiliteです。対照的に、尾部領域から精子細胞を前方回等張媒体中に置かれた前進運動を受ける。精巣上体精子細胞は、 デノボタンパク質生合成することができないので、精子の機能を調節するすべての本質的な経路は、翻訳後修飾（PTM）を介してでなければなりません。それゆえ、そのプロテオミクスを理にかなって、私たちは精子細胞の成熟を理解するのであれば、特にリン酸化などののPTMの調査は、主要な推進力である必要があります。 別の方法は、13-16レトロバックフラッシュを使用するepididymidiesから精子を得る。この技術は、確かに多くの時間がかかり、オペレータによる熟練度が大きくかかりますが、一貫して得られた精子は、99.99％を超える純度を示す。加えて、すべての他の技術とは異なり、精子CAnは、それが可能な精子の運動が開始されるかを研究すること、静止状態で単離する。試料調製は、プロテオーム解析のための最も重要な側面であるため、精子の単離は、精子プロテオミクス研究の最も重要な側面の一つとなっている。このプロトコルは、精子が精巣上体尾から分離されている方法について説明しています。これに続いて、TiO 2のリン酸化ペプチドの濃縮手順は、高度に分化した精子細胞からペプチドを抽出する方法についての具体的な参照して、概説する。 MSアプローチは（運動性、受精能、先体は、等を反応させた）精子を研究するために、この強力なアプローチをする1を別の状態（不動または非受精能）で尾側精巣上体精子を比較した場合に変化リン酸化ペプチドを区別するために使用することができます機能。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>195464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-D Quantitation Kit</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>80-6483-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonia Solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>1300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10077.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O6440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine-L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes (free acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetic acid free acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Res. Org.</td>
			<td>0090M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10158.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll (sterile)</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>GEHE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td>
			<td>PIE78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Medical Store</td>
			<td>CH 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10247.4V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure Grade</td>
			<td>Amresco (Astral)</td>
			<td>AM0497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin Gold-Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">NN2038R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">SS035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4.2 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Braided silk (5-0)</td>
			<td style="width:175px;">Dynek</td>
			<td style="width:129px;">CSS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TiO2 beads (from disassembled column)</td>
			<td style="width:175px;">Titansphere</td>
			<td style="width:129px;">6HT68003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C7B30</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">C0856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphopeptide analysis of rodent epididymal spermatozoa

精子は、細胞型の中で非常にユニークです。精巣で生産さが、事前カーソル円形細胞が細長く、形態学的に精子と認識されているものに分化し始めると、核遺伝子の転写と翻訳の両方がオフになります。しかし、精子は運動性や卵認識のための能力を有していない、非常に未熟である。これらのイベントの両方が一度精子トランジット精巣上体として知られている二次臓器を発生する。精子細胞は、精巣上体を通過するのにかかる〜12日経過時に、既存のタンパク質の翻訳後修飾は、細胞の成熟に重要な役割を果たしている。このように一つの主要な面は、タンパク質のリン酸化である。精子成熟の間に起こるリン酸化事象を特徴づけるために、純粋な精子細胞集団およびホスホペプチドのプレ分画の両方が確立されなければならない。フラッシング法、純粋な精子oの単離のための方法を使用してバック遠位または尾側精巣上体からF高品質と歩留まりが概説されている。可溶化、消化、及びTiO 2アフィニティークロマトグラフィーを経て精子ホスホペプチドの前分画のための手順が説明されている。単離されると、ホスホペプチドは、特定のアミノ酸残基が両方のタンパク質リン酸化事象を識別し、精子成熟過程の間に起こるリン酸化のレベルを定量するためにMSに注入することができる。

任意のプロテオーム解析からの結果の品質は、出発材料に大きく依存している。現代のMSと、試料調製のわずかな汚染が容易にピックアップされる。したがって、高純度の精子を提供する方法を選択すること、精子細胞プロテオミクスの場合には、重要である。 図1に示すように、逆行バックフラッシュは、精巣上体尾から精子細胞を取得するために使用されます。これは、1つはゆっくり添付注射器から空気の圧力を適用することができたPEチューブを輸精管をカニューレ挿入が含まれます。 図1Aは、輸精管と一緒に精巣上体尾を示しています。 図1Bは、輸精管がどこに縛られる方法のクローズアップショットですカニューレが挿入されている。そうすることで、そのように、精子は尾側精巣上体から1細管の切除された終了時に解放されている。 図2Aに示すように、精子はcaudの頂点領域から抽出され精巣上体とは、静止状態（ 図2B）でガラスキャピラリー内に吸い上げている。これは、前と運動性の活性化後の精子のphoshoproteomic分析を実行する能力ではなく、少なくともそれらの従来の「スイムアップ」方法に優るいくつかの利点を有する。精子は、1つの選択したメディアに排出することができる。 図2C（左手側）精子がBWW培地中に追放した直後にどのように見えるかを示しています。細胞の多くは、一緒に凝集されている。それらは、溶液（ 図2C、右側細胞）に均一になるまで泳いしかし、10分後の細胞の能力が実証されている。バックフラッシュ技術は、精子細胞にほとんど影響を持っているので、我々は100％の運動性に近い取得し、細胞が外部の挑発せずにメディアに急速に分散させる。典型的なバックフラッシュ実験では、精子はスイスマウスが含まれていますから回収6×10 5の間の細胞。これは、動物の年齢に大きく依存しており、マウスの異なる株から変化することができる。ノルウェーのラットでは、我々は一般的に±20％、200×10 6精子を得る。 図2Dは ​​、ラットの精巣上体尾から得た精子の純度を表します。 サンプル自体の他に、試料調製に関する主要な課題の一つは、トリプシン消化の収率。タンパク質沈殿は、MSと互換性のない、どちらも不要な洗剤および塩を除去するのではなく、タンパク質を変性させるだけでなく、主要な役割を果たしている。私たちは最高の仕事をするメタノール - クロロホルム沈殿を発見した。のみならず、この手順は、TCA沈殿19を含む他のものより優れた低濃度タンパク質を沈殿させることが報告され、それは追加の利点を有している。 TCA沈殿に続いて、それは非常に残ることができるTCAペレットの中断後、pHを再調整することが必要である酸性。 TCAの沈殿したペレットは、酸を除去し、高有機溶液中で洗浄することができますが、これは、結果の取り扱いと非再現性をサンプリングする追加されます。酸を中和するのに失敗すると、貧弱なトリプシンペプチドの収量をもたらす。メタノール-クロロホルム降水量だけでなく、速いですが、サンプルを酸性化しません。 図3は、一般的に下限と上限相間間の試料を100μgから見たタンパク質ペレットを示している。 ホスホペプチドの単離は、多数の方法で生じ得る。しかし再現性は、サンプルが、この段階を含むまでに取り扱わとされている方法によって異なります。より一般的に、現像方法の一つは、もともとマーティンラーセン18,20,21のグループによって開発されたTiO 2である。マイクロカラムに使用するための処理として説明したが、我々は、バッチクロマトグラフィーを用いて再現性のあるデータを得ることができる。プロセスの成功は、怒っている必要があり、溶出緩衝液、に大きく依存している<html>正しい組成を有するE;そうでなければ、ホスホペプチドは全く溶出されていません。 非運動性（ 図4上）における精巣上体尾の精子と運動性（ 図4下）の状態からTiO 2の濃縮リンペプチドからプロトコルおよび代表的なデータの再現性のm / zから650から670を見ることができます。我々は、これが生物学的複製物17を使用しても、非常に再現性のある技術であることを実証した。時間をかけて出現する青色スジがアセトニトリルの濃度が増加するにつれてC18ナノカラムから溶出するペプチドである。明らかに、運動性の集団（n = 3で示され、nは8は、典型的に実行される）において、ペプチドクラスターは、非運動性の範囲に完全に存在しない651.5 Daの範囲の周りのモノアイソトピック質量である。タンデム質量分析は、このペプチドを同定するために使用される。 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; 図1：精巣上体尾の精巣上体尾のカニューレ挿入（A）の写真。カニューレ自体は事前に引っ張ら端の約1〜2センチ露出するようにテープで留めている。これは、細かい＃1 5watchmakers鉗子を使用して、輸精管に挿入されている。（B）カニューレが輸精管およびカニューレの両方を含むセグメントの周囲に微細な絹を結びつけることによって適所に保持される。マウスからは、尾側精巣上体細胞および流体の約2〜3μlの1×10 6 /μlの濃度で収集されます。ラット（図示せず）から、流体の約30〜40μlを、同様の濃度で得られる。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> 図2：有能な精巣上体精子を収集するために使用されるガラスキャピラリー。 （A）尾eの頂点からの1つの尿細管<html> pididymisを単離し、壊れている。これが起こるのおおよその位置が示されている。（B）画像の上部には、空のガラス毛細管を示し、底部は、以前にバックフラッシュしたラットからの1つを示している。全く血液汚染および最小の上皮細胞の混入がない。（C）精子がまだ上体流体中原液されると、それらは活性化し始めていない。精子が最初にBWW液中に放出されると、それらはコンパクトな「文字列」（左手側）として出てくる。 10分後に精子のほとんどは、任意の外部擾乱（右側）を使用せずに溶液中に泳ぐので、電池の能力を簡単に、確立されている。（D）尾側精巣上体細胞のアリコートの写真を彼らが泳ぐ残された直後外細胞の純度を示しています。 g3highres.jpg &quot;/&gt; 図3：メタノール-クロロホルム沈殿一旦精子可溶化されている、可溶性画分をメタノール-クロロホルム、タンパク質および汚染物質の除去の変性を確実にするために沈殿している。タンパク質ペレットは、メタノール/水とクロロホルム相の界面に表示されます。このペレットを乱さないように、最上層を注意深く除去する。それは、タンパク質が失われないように上相の2〜3mm程度を残すことが一般的である。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> 図4：典型的にTiO 2富化ホスホペプチドプロファイル記載のプロトコルを使用して、尾精巣上体精子不動（上、N = 3）または運動状態のいずれかで単離した（下、N = 3）。 〜651.5 Dのモノ同位体質量を有するペプチドクラスター運動性の集団に存在するが不動のもの（矢印）で完全に存在しないことが示されている。この種の比較は、「ラベルフリー（MSベース）」と呼ばれる。ペプチド質量および保持時間は、次いで、タンデム質量分析のための化合物を標的とするペプチドが由来するタンパク質を同定するために使用される。

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Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

phosphopeptide-analysis-of-rodent-epididymal-spermatozoa

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K ビュー.  University of Newcastle. Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

ビデオ: Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

げっ歯類の新生児から一次分離した中脳ドーパミン細胞培養

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

生物学

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

腱板断型ボトルの培養システムを使用してげっ歯類全胚培養の方法

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

新外科医のための齧歯類の外科の原則

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

トランスジェニック齧歯類アッセイ男性生殖細胞変異頻度を定量化するための

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

心筋パフォーマンスと酸素消費量の研究のための齧歯類のワーキングハートモデル

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents have become essential models for cardiovascular research. However, spontaneous lethal cardiac arrhythmias that often cause mortality in heart disease patients are rare in rodent models of heart disease. This is primarily due to the species differences in cardiac electrical properties between human&#160;and rodents and poses a challenge to the study of cardiac arrhythmias using rodents. This protocol describes an approach to enable efficient transgene expression in mouse and rat ventricular myocardium using echocardiography-guided intramuscular injections of recombinant virus (adenovirus and adeno-associated virus). This work also outlines a method to enable reliable assessment of cardiac susceptibility to arrhythmias using isolated, Langendorff-perfused mouse and rat hearts with both adrenergic and programmed electrical stimulations. These techniques are critical for studying heart rhythm disorders associated with adverse cardiac remodeling after injuries, such as myocardial infarction.

The present protocol describes methods for transgene expression in rat and mouse hearts by direct intramyocardial injection of the virus under echocardiography guidance. Methods for the assessment of the susceptibility of hearts to ventricular arrhythmias by the programmed electrical stimulation of isolated, Langendorff-perfused hearts are also explained here.

げっ歯類の心臓におけるウイルス導入遺伝子発現と心不整脈リスクの評価

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Methods Article

齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析