膝蓋下脂肪パッド由来間葉系幹細胞、または要するにIFP-MSCは、比較的研究されていない幹細胞タイプです。このプロトコルは、ヤギの窒息関節からのIFP-MSCの分離を実証する、シンプルで信頼性が高く、再現性のある方法です。この技術の主な利点は、高品質のIFP-MSCを多数得ることができることです。
単離されたIFP-MSCは、複数の系統に分化し、広範な再生可能性を有する。IFP-MSCは、その解剖学的位置により、変形性関節症における軟骨欠損の修復および軟骨劣化の緩和に関心を集めています。この方法は、組織工学および再生医療の分野における細胞ベースの治療に影響を及ぼします。
IFP-MSCの分離、拡大、および分化の手順は、菅田ハズラ博士とアマンマハジャン氏によって実証されます。膝蓋骨下脂肪パッド間葉系幹細胞(IFP-MSC)の分離を開始するには、滅菌された収集サンプルボックスに後肢の大腿骨および脛骨領域の約15センチメートルを含むヤギの大腿骨関節を収集します。サンプルを摂氏4度で保管し、さらなる処理のために実験室に輸送します。
サンプルを150ミリメートルのペトリ皿に置き、手順全体を通してサンプルを無菌的に処理し、バイオセーフティキャビネットで処理するようにしてください。抗生物質を添加したオートクレーブ滅菌PBSで十分にすすいでください。PBSを使用してサンプルを水和してください。
サンプルの解剖学的領域を注意深く調べます。簡単にアクセスできるように、片手で大腿骨の端面を持ち、鋭利なハサミを使用して関節に向かって縦方向に切断することにより、両方の長骨から余分な組織を完全に取り除きます。その後、関節包周囲の組織を乱すことなく、筋肉と脂肪組織を骨から取り除きます。
同様に、サンプルの脛骨端に別の切開を行い、脛骨から筋肉と脂肪組織を取り除きます。両方の長骨が完全に露出し、関節包が見えることを確認してください。次に、滑膜の両側から切開を行い、関節関節を切り開きます。
新鮮な滅菌ハサミと鉗子を使用して、滑膜と膝蓋骨靭帯から膝蓋骨を切り取ります。分離した膝蓋骨をPBSを含むペトリ皿にすぐに入れます。分離した膝蓋骨から、はさみと鉗子を使用して内面に存在する脂肪パッド全体を取り除きます。
別の新鮮なペトリ皿にそれを集めて、メスを使ってそれをひきます。約2〜3ミリメートルの小さな脂肪セグメントを得るために他の手術器具を含めます。スパチュラを使用してミンチ組織を50ミリリットルの遠沈管に移し、抗生物質を添加したPBSで試験管ミキサーを使用して室温で15分間3回洗浄します。
酵素消化のために、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で約5グラムのミンチ組織を、1ミリリットルあたり1.5ミリグラムのII型コラゲナーゼと2%FBSを含む低グルコース培地で摂氏37度で12〜16時間インキュベートします。消化された組織を注意深く吸引し、70ミクロンのセルストレーナーでろ過して、未消化の部分を取り除きます。ろ液を15ミリリットルの遠沈管で150倍gで5分間遠心分離します。
細胞ペレットをDMEM低グルコースで2回洗浄する前に上清を除去した。ペレットを完全なDMEM(膨張培地とも呼ばれる)に再懸濁します。細胞を150ミリメートルのペトリ皿に播種し、塩基性線維芽細胞成長因子(BFGF)のミリリットルあたり5ナノグラム、およびミリリットルあたり50マイクログラムの2-ホスホ-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩を添加した増殖培地で培養します。
5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で細胞をインキュベートし、細胞を接着して増殖させます。細胞の付着と成長を毎日監視します。IFP-MSCの適切なメンテナンスと拡張のために、3日ごとにメディアを交換してください。
培地を交換しながら、ミリリットルBFGFあたり5ナノグラムと2-ホスホ-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩のミリメートルあたり50マイクログラムをペトリ皿に直接加えます。細胞が80%から90%コンフルエントになったら、ペトリ皿から増殖培地を除去し、1X PBSで細胞を洗浄して継代培養します。次に、4ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAを皿に加え、5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で細胞をインキュベートします。
4分後、プレートの側面を軽くたたいてセルを取り除きます。顕微鏡下ですべての細胞の完全な剥離を確認します。確認したら、等量の膨張培地を加えてトリプシンを中和します。
ピペットを使用して、これらの解離した細胞を新しい15ミリリットルのポリプロピレンチューブに集め、室温で5分間150倍gで遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを所望の容量の膨張培地に再懸濁する。標準的な細胞計数法を用いて細胞を計数し、150ミリリットルのペトリ皿に1平方センチメートル当たり10, 000細胞を播種密度でさらに増殖させるために継代培養する。
全てのアッセイについて、継代数P2〜P5の細胞のコンフルエント単層を使用する。増殖した細胞が80%から90%のコンフルエントに達したら、トリプシン-EDTA溶液を使用して細胞を解離してから、15ミリリットルの遠沈管で150倍gで5分間ペレット化します。次に、ペレットを50マイクロリットルあたり200万細胞の密度でヤギ血漿中に再懸濁します。細胞を含む50マイクロリットルの血漿を滅菌した90ミリメートルのペトリ皿に加え、続いて最終濃度0.3%の塩化カルシウムを加えてよく混合して架橋血漿ヒドロゲルを作製する。
作製したヒドロゲルを摂氏37度で40分間インキュベートした後、軟骨形成培地を含む24穴組織培養プレートにヒドロゲルを移します。メディアを 3 日ごとに 14 日間交換します。TGF−β1を含まない完全なDMEM培地で培養されたヒドロゲルは、非誘導対照とみなされる。
血漿ヒドロゲル中で細胞の軟骨形成分化の14日後、ヒドロゲルをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、サンプルを中性緩衝ホルマリンに3時間固定します。単離されたIFP-MSCは均質に接着し、in vitro培養から24時間以内に細長い形態を達成しました。細胞は増殖から6日以内に80%から90%のコンフルエントに効率的に増殖し、クローン生成能力を示し、効率的な増殖能力と自己複製能力を示しました。
脂肪生成系統に分化するように処理した場合、単離された細胞は脂肪滴を産生し、これは14日目および21日目にOil Red O染色によって確認された。このような油滴は、脂肪生成誘導因子のない細胞では見えなかった。血漿ヒドロゲルに封入された単離された細胞は、軟骨形成能を示した誘導群において14日後に白色および光沢のある新組織の形成を示した。
非誘導群は、光沢度が低下した淡い白色組織を有していた。さらに、誘導群のアルシアンブルーとサフラニンOの陽性組織学的染色は、細胞が軟骨基質の主要成分の1つである硫酸化グリコサミノグリカンを分泌できることを示しました。対照的に、誘導されていないグループのヒドロゲル切片は、サフラニンOおよびアルシアンブルー染色に対して陰性であり、軟骨形成刺激の存在下でのみ間葉系幹細胞の軟骨形成分化能が確認された。
骨形成培地で誘導された単離細胞は、アルカリホスファターゼに対して陽性染色を示し、14日の終わりに石灰化を確認した。骨形成誘導の28日後、石灰化沈着物をアリザリンレッドS染色で観察した。結果は、誘導された細胞が脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成系統に分化する可能性を強調しました。
汚染を避けるために、無菌条件下でサンプルを処理することが不可欠です。膝蓋骨の正しい位置を特定することも重要です。関節軟骨細胞、靭帯線維芽細胞、幹細胞など、滑膜や滑液から様々な細胞型を分離する道を開き、再生医療に幅広く応用できます。
この手法を用いてIFP-MSCを単離した後、足場および足場のないアプローチを使用して、軟骨、骨、靭帯などの筋骨格組織の再生に対してその有効性を特に調査しました。
