このプロトコルは、転写因子コード遺伝子のエピトープタグ付けから計算データ解析まで、CUT&RUNを介してカンジダ・アルビカンスにおける転写因子-DNA結合相互作用のゲノムワイドプロファイリングを実行するためのすべての実験手順を詳述しています。これは、よりアクセスしやすく、高速で、より敏感で、より安価な技術であり、従来のChIPチップおよびChIP-seqアプローチよりも高品質のデータを提供します。私たちのプロトコルは、バイオフィルムまたはプランクトン培養物から単離されたカンジダ・アルビカンス細胞のために開発されていますが、カンジダ・アルビカンス細胞の事実上あらゆる良い形態に適応させることは実用的であるべきです。
細胞懸濁液をインキュベートした後、5マイクロリットルのアリコートを新しいPCRチューブに移す。5マイクロリットルの単離された核および以前に摂氏4度で保存された無傷の細胞の5マイクロリットルのアリコートに、カルコフルアホワイトおよびSYTO 13のそれぞれ1マイクロリットルを加える。暗闇の中で摂氏30度で30分間インキュベートする。
蛍光顕微鏡を用いて単離された核の完全性および純度を目視で検査する。顕著なSYTO 13染色を示す単離核を探し、カルコフルア白色色素による細胞壁染色がないことを確認します。カルコフルアホワイト色素による細胞壁染色の対照として無傷の細胞で検査を繰り返す。
チューブを磁気ラックに置き、スラリーが完全に透明になるまで待ちます。上清はピペットを用いて廃棄する。50マイクロリットルの抗体緩衝液を加え、ピペッティングにより穏やかに混合する。
3マイクロリットルの抗GFPポリクローナル抗体をチューブに加え、チューブを4°Cのナッティングミキサー上で2時間インキュベートする。チューブを室温で100倍gで5秒間短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置きます。スラリーが透明になったら、ピペットを用いて上清を捨てる。
ビーズの入ったチューブがまだ磁気ラック上にある間に、200マイクロリットルの氷冷セル透過処理バッファーをビーズに直接加えます。上清はピペットを用いて廃棄する。氷冷細胞透過処理バッファーで2回洗浄を繰り返します。
各チューブに50マイクロリットルの氷冷細胞透過処理バッファーを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。各サンプルに2.5マイクロリットルのタンパク質AG-MNaseを加え、ピペッティングによって混合する。サンプルを摂氏4度のナッティングミキサーに置き、サンプルを1時間インキュベートします。
ストリップチューブを室温で100倍gで5秒間短時間遠心分離し、次いでチューブを磁気ラック上に置く。スラリーが透明になったら、ピペットを用いて上清を捨てる。ビーズの入ったチューブがまだ磁気ラック上にある間に、200マイクロリットルの氷冷セル透過処理バッファーをビーズに直接加えます。
上清はピペットを用いて廃棄する。氷冷細胞透過処理バッファーで2回洗浄を繰り返します。100マイクロリットルの氷冷細胞透過処理バッファーをサンプルに加え、5回軽くピペットを上下させます。
ゲルキャストをゲルボックスから取り出し、製造元の指示に従ってゲルキャストを開きます。ゲルキャストからゲルを静かに取り出し、100ミリリットルの単一強度TBEを含むゲル保持トレイの中に置きます。10マイクロリットルの核酸ゲル染色剤をトレイに加え、静かに旋回させる。
ホイルで覆い、光から保護し、室温で10分間静的にインキュベートする。その後、100ミリリットルの脱イオン水道水でゲルを2回すすいでください。青色光照明下でゲルを画像化し、琥珀色のフィルターカバーを使用します。
各ライブラリーについて、ゲルを約125塩基対の顕著なアダプターダイマーバンドのわずかに上および400塩基対のラダーマークより下に切断する。22ゲージの針を使用して0.65ミリリットルのチューブの底部を穿刺し、滅菌された2ミリリットルのマイクロフュージチューブの中に穿刺チューブを置きます。ゲルスライスを2ミリリットルのマイクロフュージチューブ内の穿刺チューブに移す。
65ミリリットルの穿刺管を入れた2ミリリットルのマイクロフュージチューブを室温で10,000倍gで試料を2分間遠心分離し、2ミリリットルのマイクロフュージチューブ内部のゲルスラリーを回収した。300マイクロリットルの氷冷ゲル溶出緩衝液をゲルスラリーに加える。室温で栄養器で最低3時間または一晩混ぜる。
すべての液体およびゲルスラリーを0.22マイクロメートルのフィルターカラムに移し、室温で10,000倍gで1分間遠心分離する。GitHub ページから CUT&RUN 解析のソースコードをダウンロードするには、緑色の [コード] ボタンをクリックし、[ZIP のダウンロード] オプションをクリックします。フォルダーをローカル コンピューター上の関連する場所に解凍します。
Conda 環境をインストールし、1 回だけ実行します。Conda がインストールされたら、関連するコマンドで提供される仮想環境を作成します。このワークフローが実行されるたびに仮想環境をアクティブ化します。
細胞壁消化および核完全性は、蛍光細胞壁および核酸染色で染色された対照無傷の細胞および単離された核の両方を視覚化することによって評価した。細胞壁染色が観察されない単離された無傷の核とは対照的に、核および細胞壁の両方が、無傷の対照細胞において蛍光標識される。図は、キャピラリー電気泳動装置を使用して分析されたCUT&RUN TFライブラリを示しています。
成功した CUT&RUN TF ライブラリは、200 塩基対未満の短いフラグメントに対して強化されます。最適でないCUT&RUN TFライブラリは、大きなDNA断片の濃縮度を示す。本明細書の図は、CUT&RUNによって同定されたすべてのNdt80結合遺伝子座にわたってNdt80DNA結合モチーフが富化されていることを示し、この方法論によって同定される追加のピークが、Ndt80結合部位である可能性が高いことを示している。
比較解析により、CUT&RUNプロトコルは、バイオフィルム形成中のNdt80およびEfg1に対する以前に知られていた結合事象のほとんどを同定したことが示された。全体として、遺伝子座に結合したNdt80およびEfg1の両方が、以前に発表されたクロマチン免疫沈降ChIPデータと重複しており、CUT&RUNを用いてのみ同定される。これにより、転写調節ネットワークとカンジダ・アルビカンスに焦点を当てた研究の範囲とペースを大幅に拡大することができます。
