神経膠芽腫は、高い侵襲性プロファイルを持つ壊滅的な脳腫瘍です。この共培養システムは、神経膠芽腫細胞の移動を模倣して、患者で観察された侵襲的経路の1つを再現する。共培養モデルの幾何学と組成は、精密に制御されています。
それはよりよい再現性および複雑な生物学的プロセスの簡単な定量化を促進する。この方法は、解化したばかりの神経膠芽腫細胞およびニューロンを共培養することによって臨床診断に適応することができる。これは、臨床指標を定義します, 臨床結果として非常に重要です.
この方法は、線維芽細胞や免疫細胞などの他の移動細胞を定量化するためにも使用できます。この手順をデモンストレーションするのは、私のチームの博士課程の学生、ジョリス・ギヨンです。マイクロパターニング用の基板を作るために、18ミリメートルの円形ガラスカバーリップを空気またはプラズマ活性化で5分間処理してから、100マイクロリットルのトリエトキシシランを付けたデシケーターにカバースリップを1時間置き、PEG-SVAの溶液を1ミリリットル当たり100ミリグラムで1時間インキュベートします。
ゲル沈着の場合、インキュベーションの終わりに、PLPPの3マイクロリットルと50マイクロリットルの絶対エタノールをスライドの中央に加え、完全に乾燥するまで待ちます。ガラススライドのマイクロパターニングの場合、カバースリップをLudinチャンバーに取り付け、自動焦点システムを装備した顕微鏡のステージにチャンバーを配置します。イメージングの後、マイクロパターンイメージをソフトウェアにロードします。
自動UV照明シーケンシングの後、ピペットを使用して、PBSで広範囲にカバースリップからPLPPを洗浄します。その後、ラミニン1ミリリットル当たり50マイクログラムでカバースリップを30分間インキュベートし、続いてPBSで別の洗浄を行います。マイクロパターンのカバーリップ上に胚性ラット海馬ニューロン培養をセットアップするには、最後の洗浄後、神経細胞培養培地でガラススライドを再水和する。
種子50〜第4ラット海馬ニューロンは、摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで24時間インキュベートのために各マイクロパターン化カバースリップに平方センチメートルあたり3%馬の血清で濃縮神経基底培地に懸濁した。遠心分離機は、1,000RPMで5分間神経膠芽腫細胞を解約し、グリオブトーマ細胞培地中のペレットを再懸濁し、次いでマイクロパターン化されたニューロン上に10回3番目のGBM細胞に沈着した。細胞の生きた細胞イメージングのために、37°Cのサーモスタットチャンバーを備えた逆顕微鏡のステージに共培養を置き、20X目的を選択します。
次に、顕微鏡ソフトウェアの多次元取得ツールボックスを使用して、ニューロンを持つパターンの数に基づいて、16の異なる位置で12時間、ライブブライトフィールドと蛍光GFPトマト画像を2分ごとに取得します。神経ネットワーク解析では、イメージング後、スタックから画像を1つ選択します。ネットワーク ツールを右クリックして、対応するオプション ダイアログ ボックスを開き、設定を調整して、イメージの正確なセグメンテーションを作成します。
[OK] をクリックします。ネットワークツールを左クリックして、選択した画像を複製し、画像を赤、灰色、緑のカラーチャンネルに分割します。グレーのチャンネルを選択し、コントラストストレッチの強調を行い、異なる領域間の分離を改善します。Sobel エッジディテクタを使用して、find edge コマンドの下にグループ化された 2D 信号処理畳み込み処理を実行します。
二重フィルタリングの場合、ガウスブラーと中央値フィルタを適用してノイズを低減し、オブジェクト信号を滑らかにします。マスクに変換するには、調整されたしきい値アルゴリズムを実行して、黒と白のピクセルを持つバイナリー画像を取得します。次に、セル領域を単純なネットワークにスケルトン化し、フィルター パーティクルを使用して、結果内の小さな非ネットワーク化されたパーティクルを除去します。
ネットワーク イメージ内のネットワーク フィルタ パーティクル。赤と緑のチャンネルを取得するには、二重フィルタリングを実行し、適合したしきい値法を使用して示すようにマスクに変換します。分析パーティクルを使用して、バイナリーグリーン画像の細胞形態を決定します。
or 演算子を使用して、対象の領域を使用してすべてのチャネルを結合し、初期カラーを単純な RGB イメージに再結合します。単一セルの運動性解析を実行するには、単一セル追跡ツールを右クリックして対応するオプションダイアログボックスを開き、設定を調整して画像の正確なセグメンテーションを作成します。[OK] をクリックし、シングル セル トラッキングを左クリックしてグレーのチャンネルを削除します。
時間に応じてイメージスタックに対応する画像を生成するには、Z投影とダブルフィルタを適用し、セルが残した軌跡をマスクするように変換します。図に示すように、バイナリの赤と緑のイメージから小さなパーティクルを削除します。対象領域ツールを使用して、セル トレースの各輪郭線を選択し、オプション ダイアログ ウィンドウで [エッジ検出をスキップ] チェックボックスをオンにします。
元のスタック上の赤チャンネルを分離し、対象のリージョンを 1 つ選択します。すべての画像をダブルフィルターし、マスクに変換して、各二項核の重心XY位置を決定できるようにします。XY 位置を使用して、セルの平均平方変位、方向比、平均速度を計算できます。
複数のセル追跡解析の場合は、トラッキング ツールを右クリックして対応するオプション ダイアログ ボックスを開き、設定を調整して画像の正確なセグメンテーションを作成します。トラッキングツールを左クリックしてグレーのチャンネルを削除します。赤と緑のチャンネルを分割し、ダブルフィルター、マスクに変換します。
次に、画像計算コマンドと演算子を使用して、膜内に位置する核信号のみを残すチャネルをマージし、示されているように、軌道プロット、平均平方変位、方向比、および平均速度を計算します。パターン化されたニューロンと共培養された蛍光GBMは、その形状を素早く変更し、ランダムな動きでニューロンエクステンションに沿った移動を示します。ニューロンに播種されたGBM細胞は、ニューロントラックに従う複数の突起を有する細長い形状を示し、ラミニンで培養すると丸みを帯びた形状を保持する。
培養の後期段階では、細胞にリンクする薄い突起がGBMニューロン共培養で観察され得る。ニューロンに播種されたGBM細胞は、これらの軌道プロットで観察されるようにラミニンに播種されたGBM細胞よりも大きな回遊能力を示す。細胞の蛍光合流の分析は、500分の観察期間にわたって、細胞がラミニン単独で培養される場合よりも、スフェロイドがニューロンと共培養されると、より多くの細胞移動が観察されることを示している。
確かに分析の終わりまでに、パターンのほぼ半分はGBM細胞で覆われ、ラミニン上で培養されたスフェロイドはカバースリップに未接着のままである。答えたい生物学的な質問に応じて、パターンデザインと細胞密度が生体内条件を表すので注意する必要があります。細胞は共焦点顕微鏡によって固定され、イメージ化することができる。
この方法ではイメージング機能が損なわれないので、ライブイメージングも可能です。この技術は、神経膠芽腫細胞とニューロンの代謝交換などの分子相互作用を研究するのに適しています。それは機能生物学的プロセスの探索を可能にする。
高スループットの実験は、臨床目的のためにも行うことができます。
