このプロトコルは、サンプルの収集から調製まで、真菌従属栄養植物の真菌コロニー形成を理解するために適用される多様な顕微鏡技術を提示し、重要なステップを含みます。このような技術は、様々な菌従属栄養植物に適用することができ、さらには菌従属栄養植物以外の植物の材料にも適用することができる。この方法は主に構造植物学に関連しており、菌根相互作用、生理学、生殖生物学、進化、および菌従属栄養植物の生態学への洞察も提供する可能性があります。
はじめに、地下器官を傷つけないように注意しながら、植物ベースの周りの土壌を探索することによって、菌従属栄養植物を集めます。また、地下の臓器から空中の臓器が外れないように、植物を地面から引っ張ることは避けてください。慎重に、ガーデニングこてを使用して空中構造物を掘り起こし、根、茎、根茎、貯蔵器官などの地下器官を損傷することなく探索します。
汚れやすい構造を保存するために土壌粒子を取り除き、サンプルを固定する前に、これらの臓器を水道水で繊細に洗い流して残りの土壌粒子を洗い流します。落葉に関連する菌従属栄養植物は特別な注意を必要とします。したがって、分解材料に接続されている繊細な臓器を、接続された構造から引っ張ることなく、菌糸を通して慎重に収集します。
そのような接続を持つ構造を保存し、分析のためにゴミを集めます。透過型電子顕微鏡分析では、厚さ3〜4ミリメートルのサンプルをグルタルアルデヒドカコジル酸ナトリウムバッファーの滴の中に入れて、厚さ1〜2ミリメートルの小さな切片に分割します。ドロップの外側のカットエッジを破棄します。
植物の収集直後に収集場所で固定プロセスを実施するようにしてください。添加剤の固定液であるため、サンプルの体積の10倍以上の固定液の量を持つ収集チューブに切片を直ちに移します。臓器、特に地下のものや落葉と接触している臓器の表在菌糸の表面分析用。
新鮮な材料または固定された材料を解剖顕微鏡で7.5倍以上の倍率で観察します。表在性菌糸と根茎によって導かれる関心のある領域を検索します。表面根茎の領域を含むサンプルを選択して、根と茎の皮質細胞内のペロトンと菌糸コイルを視覚化することができます。
テキスト原稿に記載されているように、小麦胚芽凝集フルオロクロムコンジュゲートのミリリットルあたり0.2ミリグラムと0.1モルのリン酸緩衝液中の1%カルコフルオロア白色溶液を調製します。次に、スライドガラス上の切片を小麦胚芽凝集活性色素コンジュゲート溶液で30分間適切に覆ってインキュベートします。インキュベーション後、切片を0.1モルのリン酸緩衝液で洗浄し、封入媒体としてカルコフルール溶液中でインキュベートします。
次に、スライドにカバースリップを置き、指示されたフィルターを使用して共焦点または蛍光光学顕微鏡で観察します。サンプルを固定し、脱水を行い、70%エタノールに保存した後、鋭利で新しいかみそりの刃を使用して一方向の動きで切り込みを入れ、走査型電子顕微鏡分析に必要な表面を露出させます。必要に応じて、実体顕微鏡を使用してサンプルを選択し、サンプルサイズを決定する際に金属スタブ領域を考慮します。
さらに、エタノール系列でサンプルを脱水する。小さくて繊細なサンプルを各濃度で30分間維持し、大きくて密度の高いサンプルを1時間維持します。次に、ティッシュペーパーを使用して小さな封筒を折り、次のステップのためにサンプルを整理します。
より大きなサンプルは封筒なしで扱うことができます。鉛筆を使用して封筒にラベルを付け、サンプルのログを保管します。慎重に、絵筆を使用して封筒の中にサンプルを置きます。
次に、これらのサンプルを絶対エタノールに保管します。標準的な操作手順に従って臨界点乾燥機を操作することにより、臨界点乾燥を直ちに進めます。このためには、サンプルをサンプルホルダーの絶対エタノールに入れ、臨界点乾燥機の圧力チャンバー内に置きます。
中間流体は臨界二酸化炭素点で遷移流体に溶解し、サンプルを乾燥させます。大気中の湿度を再吸収するとサンプルが破壊される可能性があるため、臨界点乾燥後すぐに乾燥容器に保管してください。サンプルを金属スタブに取り付ける前に、手袋を着用してスタブを操作します。
アセトンに5分間浸して脂肪を取り除き、乾かします。実体顕微鏡下で、導電性両面カーボン粘着テープを使用してサンプルをスタブに固定し、配置します。上からのサイトは、走査型電子顕微鏡画像で唯一の可能な遠近法です。
サンプルを操作するには、ファインポイントピンセットを使用します。ピンセットが触れたサンプル部分は通常損傷しています。したがって、注意して、関心のある領域から離れた場所にある部品に触れてみてください。
シリカゲルを含む密封されたペトリ皿にサンプルを含むスタブを維持します。次に、標準操作手順に従って不活性ガスの低圧雰囲気下で試料の表面に金または白金の層を堆積させるスパッタコーティングを進めます。コーティングの厚さはサンプルのトポグラフィーに依存し、通常は15〜40ナノメートルです。
最後に、コーティングされたスタブを、湿度を保持するシリカゲルで密封されたペトリ皿に維持します。サンプルはこの方法で数週間保存できます。走査型電子顕微鏡を使用して、これらのサンプルを分析します。
走査型電子顕微鏡中に電子ビームが真空中の試料に当たり、そのような相互作用からの信号放出は画像として解釈されます。種子の共生発芽に使用される溶液と材料が無菌であることを確認してください。汚染を避けるために。
摂氏121度で20分間オートクレーブすることから始めます。層流フードで、果物と種子を2%活性塩素を含む次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸して表面的に消毒します。スリムで壊れやすい種子は、1:1の希釈次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸すことができます。
消毒後、ゼログラフィック布を使用して種子をろ過して種子を回収します。発芽試験に進む前に、オートクレーブ滅菌した蒸留水で果物と種子を3回洗浄して次亜塩素酸塩溶液を除去します。必要に応じて、摂氏4度のシリカゲルを含むガラスフラスコ内の濾紙封筒に保管し、フラスコを密閉して粘着フィルムで密封し、最後の洗浄からジャガイモデキストロース寒天に数滴の水を移して洗浄プロセスの有効性を評価します。
ランの種子の共生発芽のために、オートミール寒天培地を含むペトリ皿に入れた1〜2センチメートルのオートクレーブ処理されたろ紙ディスクで種子をインキュベートします。次に、ペトリ皿の中央に、選択した単離された真菌からの菌糸体を含む培養液の断片を接種します。ペトリ皿を粘着フィルムで密封し、真菌の成長に応じて、摂氏約25度または室温で暗闇でインキュベートします。
発芽試験のための陰性対照として、種子と真菌接種なしでいくつかの皿を準備します。定量的および定性的なデータを収集し、原球と苗を撮影することにより、発芽結果を毎週分析します。根茎は通常、暗い靴ひものような構造として簡単に認識できます。
フリーハンドまたは10マイクロメートルより厚い切片を得る他の方法は、プロトンをよりよく証明し、コロニー形成の真菌パターンのより代表的な画像を提供することができる。フリーハンド切片は、高増幅における菌糸分析にも適しています。ただし、詳細は薄いセクションでより適切に達成されます。
木部要素の二次細胞壁は、トルイジンが獲得する明るい色によって容易に識別することができる。一方、一次細胞壁のみで構成される師部要素は、細胞壁が薄くて暗いことで識別されます。自家蛍光によるアーチファクトは、グリコールメタクリレート樹脂切片に見られます。
これらのアーチファクトは通常、蛍光色素濃度に関連しており、バッファーでサンプルを複数回洗浄することで回避できます。根のフリーハンドセクションは、内部および外部の菌糸を示しています。同じ器官は、その表面に豊富な根粒菌と個々の菌糸を備えた走査型電子顕微鏡によって見ることができます。
ほとんどのラン種は、接種された真菌に感染してから数週間以内、またはほぼ1か月以上まで発芽します。走査型電子顕微鏡の光を花、果実、種子に適用して、生殖生物学やマイコ従属栄養植物を調べることができます。種子の共生発芽は、独立栄養ランでも試験することができます。
