Il protocollo presenta diverse tecniche di microscopia applicate per comprendere la colonizzazione fungina nelle piante micoeterotrofiche, dalla raccolta alla preparazione dei campioni in dettaglio e include passaggi essenziali. Tali tecniche possono essere applicate a varie piante micoeterotrofe e persino a materiali di una pianta diversi dai micoeterotrofi. Questo metodo è principalmente legato alla botanica strutturale e potrebbe anche fornire approfondimenti sulle interazioni micorriziche, la fisiologia, la biologia riproduttiva, l'evoluzione e l'ecologia delle piante micoeterotrofiche.
Per iniziare, raccogli le piante micoeterotrofe esplorando il terreno intorno alla base vegetale, facendo attenzione a non danneggiare gli organi sotterranei. Inoltre, evitare di tirare le piante da terra per evitare di scollegare gli organi aerei da quelli sotterranei. Con attenzione, scava intorno alle strutture aeree usando una cazzuola da giardinaggio mentre esplori gli organi sotterranei come radici, steli, rizomi e organi di stoccaggio senza danneggiare queste strutture.
Rimuovere le particelle di terreno per preservare le strutture fragili e lavare delicatamente questi organi con acqua di rubinetto per risciacquare le particelle di terreno rimanenti prima di fissare i campioni. Le piante micoeterotrofiche associate alla lettiera di foglie richiedono particolare attenzione. Quindi, raccogli con cura i delicati organi collegati al materiale in decomposizione attraverso le loro ife senza estrarli dalle strutture collegate.
Preservare le strutture con tali connessioni e raccogliere i rifiuti per l'analisi. Per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione, sezionare i campioni spessi da 3 a 4 millimetri all'interno di una goccia di tampone di cacodilato di sodio glutaraldeide in sezioni più piccole di spessore da 1 a 2 millimetri. Scartare i bordi tagliati all'esterno della goccia.
Assicurarsi di condurre il processo di fissazione nel sito di raccolta immediatamente dopo la raccolta delle piante. Trasferire immediatamente le sezioni in una provetta di raccolta con un volume di fissativo superiore a 10 volte superiore al volume dei campioni in quanto è un fissativo additivo. Per l'analisi superficiale delle ife superficiali negli organi, specialmente in quelli sotterranei e in quelli a contatto con la lettiera fogliare.
Osservare materiale fresco o fisso al microscopio da dissezione con un ingrandimento di 7,5x o superiore. Ricerca delle aree di interesse guidata dalle ife superficiali e dai rizomorfi. Selezionare i campioni contenenti aree di rizomorfi superficiali in quanto questi possono essere sezionati per visualizzare i pelotoni e le bobine di ife all'interno delle cellule corticali nelle radici e negli steli.
Preparare 0,2 milligrammi per millilitro di germe di grano agglutinina fluorocromo coniugato e 1% calcofluor soluzioni bianche in 0,1 molare tampone fosfato come descritto nel manoscritto di testo. Ora, incubare le sezioni su vetrini coprendoli adeguatamente con germe di grano agglutinina fluorocromo soluzione coniugata per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le sezioni con tampone fosfato molare 0,1 e incubarle nella soluzione di calcofluor come mezzo di montaggio.
Quindi, posizionare i vetrini di copertura sui vetrini e osservarlo al microscopio a luce confocale o a fluorescenza utilizzando i filtri indicati. Dopo aver fissato i campioni, eseguito la disidratazione e conservato in etanolo al 70%, esporre qualsiasi superficie desiderata per l'analisi al microscopio elettronico a scansione utilizzando una lama di rasoio affilata e nuova per eseguire tagli con un movimento unidirezionale. Se necessario, utilizzare uno stereomicroscopio per selezionare i campioni e considerare l'area dei mozziconi metallici mentre si determinano le dimensioni del campione.
Inoltre, disidratare i campioni in una serie etanolica. Mantenere campioni piccoli e delicati per 30 minuti in ogni concentrazione e campioni più grandi e più densi per 1 ora. Quindi, piegare piccole buste usando carta velina per organizzare i campioni per i passaggi successivi.
I campioni più grandi possono essere gestiti senza busta. Etichettare le buste con una matita e tenere un registro dei campioni. Con attenzione, posizionare i campioni all'interno delle buste usando un pennello.
Ora, conservare questi campioni in etanolo assoluto. Procedere immediatamente con l'essiccazione dei punti critici azionando un essiccatore per punti critici secondo le procedure operative standard. Per questo, posizionare i campioni in etanolo assoluto in un portacampioni e posizionarlo all'interno della camera di pressione dell'essiccatore di punti critici.
Il fluido intermedio si dissolve nel fluido di transizione nel punto critico di anidride carbonica, asciugando così i campioni. Poiché il riassorbimento dell'umidità atmosferica può distruggere i campioni, conservarli in un contenitore di essiccazione immediatamente dopo l'essiccazione del punto critico. Prima di montare i campioni su mozziconi di metallo, indossare i guanti per manipolare i mozziconi.
Immergerli nell'acetone per 5 minuti per eliminare l'eventuale grasso e lasciarli asciugare. Sotto uno stereomicroscopio, fissare i campioni sul mozzicone usando un nastro biadesivo conduttivo al carbonio e posizionarli. Il sito dall'alto è l'unica prospettiva possibile nelle immagini di microscopia elettronica a scansione.
Per manipolare i campioni, utilizzare pinzette a punta fine. La parte del campione toccata dalle pinzette è solitamente danneggiata. Quindi fai attenzione e prova a toccare le parti posizionate lontano dalle aree di interesse.
Mantenere i mozziconi con campioni in una capsula di Petri sigillata con gel di silice. Successivamente, procedere con lo sputter coating per depositare uno strato di oro o platino sulla superficie dei campioni in un'atmosfera a bassa pressione di gas inerte seguendo le procedure operative standard. Lo spessore del rivestimento dipende dalla topografia del campione e di solito è compreso tra 15 e 40 nanometri.
Infine, mantenere i mozziconi rivestiti in una piastra di Petri sigillata con gel di silice che trattiene l'umidità. I campioni possono essere conservati in questo modo per settimane. Utilizzare un microscopio elettronico a scansione per analizzare questi campioni.
Un fascio di elettroni colpisce il campione nel vuoto durante la microscopia elettronica a scansione e l'emissione del segnale da tale interazione viene interpretata come immagini. Assicurarsi che le soluzioni e i materiali utilizzati nella germinazione simbiotica dei semi siano sterili. per evitare la contaminazione.
Inizia con l'autoclave per 20 minuti a 121 gradi Celsius. In una cappa a flusso d'aria laminare, disinfettare superficialmente i frutti e i semi immergendoli in una soluzione di ipoclorito di sodio contenente il 2% di cloro attivo. I semi sottili e fragili possono essere immersi in una soluzione di ipoclorito di sodio diluito 1: 1.
Dopo la disinfezione recuperare i semi filtrandoli con tessuto xerografico. Lavare tre volte i frutti e i semi in acqua distillata autoclavata per rimuovere la soluzione di ipoclorito prima di procedere con i test di germinazione. Se necessario, conservarli in buste di carta da filtro all'interno di boccette di vetro con gel di silice a 4 gradi Celsius e chiudere ermeticamente i palloni e sigillarli con pellicola trasparente, quindi valutare l'efficacia del processo di lavaggio trasferendo alcune gocce d'acqua dall'ultimo lavaggio all'agar destrosio di patate.
Per la germinazione simbiotica dei semi di orchidea, incubare i semi su dischi di carta da filtro autoclavati da 1 a 2 centimetri posti in piastre di Petri contenenti terreno di coltura di agar di farina d'avena. Ora, inoculare il centro della capsula di Petri con il frammento di terreno di coltura contenente micelio dal fungo isolato scelto. Sigillare le piastre di Petri con pellicola trasparente e incubarle al buio a circa 25 gradi Celsius o temperatura ambiente, a seconda della crescita fungina.
Preparare alcuni piatti con semi e senza inoculazione fungina come controllo negativo per il test di germinazione. Analizza settimanalmente i risultati della germinazione raccogliendo dati quantitativi e qualitativi e fotografando protocormi e piantine. I rizomorfi possono essere facilmente riconosciuti di solito come strutture scure, simili a stringhe di scarpe.
A mano libera o altri metodi per ottenere sezioni più spesse di 10 micrometri possono migliorare i pelotoni e fornire immagini più rappresentative dei modelli fungini di colonizzazione. Le sezioni a mano libera possono anche essere adatte per l'analisi delle ife in amplificazione più elevata. Tuttavia, i dettagli sono meglio raggiunti nelle sezioni più sottili.
Le pareti cellulari secondarie negli elementi xilematici possono essere facilmente identificate dal colore chiaro acquisito dalla toluidina. Nel frattempo, gli elementi floematici composti solo da pareti cellulari primarie sono identificati dalle loro pareti cellulari più sottili e più scure. Gli artefatti per autofluorescenza possono essere visti nelle sezioni di resina glicole metacrilato.
Questi artefatti sono solitamente correlati alla concentrazione di fluorocromo e possono essere evitati lavando i campioni un numero maggiore di volte con il tampone. La sezione a mano libera della radice mostra ife interne ed esterne. Lo stesso organo può essere visto mediante microscopia elettronica a scansione con un'abbondanza di rizomorfi e singole ife sulla sua superficie.
La maggior parte delle specie di orchidee germinano entro alcune settimane dopo essere state infettate dal fungo inoculato o fino a quasi più di un mese. La luce nella microscopia elettronica a scansione può essere applicata a fiori, frutti e semi per studiare la biologia riproduttiva o le piante micoeterotrofiche. La germinazione simbiotica dei semi può anche essere testata nelle orchidee autotrofe.
