このプロトコルは、マイクロトモグラフィーを使用して分析されるサンプル中の寄生植物の組織と宿主との間のコントラストを大幅に改善します。ここで説明する手法は、サンプルを通る造影剤灌流のプロセスをスピードアップし、寄生植物と宿主との間に形成された特定の組織および構造の分析を可能にします。真空アプローチは非常に簡単で、問題はありません。
一方、灌流装置はセットアップが少し難しいかもしれません。しかし、事前に練習することが役立つかもしれません。小さな非木質サンプルの場合、真空法を使用して適用できます。
一方、豊富法は、宿主の茎または根のセグメントを含む、より大きくて木質のサンプルに使用する必要があります。真空法を使用する場合は、コントラスト溶液を含むバイアルにサンプルを入れます。次に、バイアルを真空チャンバーまたは真空ポンプに接続されたデシケーターに入れます。
バイアルから蓋を外し、真空チャンバーまたはデシケーターを閉じます。真空チャンバーまたはデシケーターに亀裂がないことを確認してください。チャンバーまたはデシケーターの排気バルブを開いて、空気を強制的に排出します。
ポンプの電源を入れ、圧力が約20インチ水銀柱、つまり10psiに達するまで待ちます。チャンバーまたはデシケーターの排気バルブを閉じて、空気が再入らないようにします。その後、すぐにポンプをオフにします。
サンプルを少なくとも2時間真空下に置いておきます。プロフュージョン法を使用する場合は、サンプルサイズに応じて供給タンクを選択してください。少量のサンプルの場合、針のない50ミリリットルのシリンジをタンクとして使用できます。
透明なプラスチックチューブの一端を供給タンクに接続します。次に、もう一方の端を双方向または三方向バルブに接続します。2番目のチューブをバルブの別の出口に接続します。
前の手順でセットアップした装置を分解せずに、供給タンクを高い位置に固定します。三方弁または二方弁を閉じて、液体がチューブシステムから出ないようにし、対照的な溶液を供給タンクに注ぎます。チューブシステムに大きな気泡がないことを確認し、バルブを再度閉じて、装置を所定の位置に残します。
造影剤溶液が豊富に存在するサンプルを調製するには、それを液体に浸したままにし、宿主の茎または根の近位端の先端を切り取ります。バルブを慎重に開いて、対照的な溶液がゆっくりと流れるようにし、対照的な溶液がこぼれないようにシステムの開放端をわずかに高い位置に保持しながら、タンクに接続されているプラスチックチューブを満たします。サンプルの宿主ステムまたは根の近位端をチューブシステムの開放端に接続します。
溶液にサンプルを少なくとも2時間灌流させるか、溶液が容器内に蓄積するまで灌流させます。バルブを閉じ、サンプルを装置から慎重に外します。サンプルを水に2分間浸して洗浄します。
サンプルを室温のペーパータオルに入れて、サンプルを完全に乾かさずに2〜5分間余分な水分を蒸発させます。サンプルをパラフィンフィルムで包み、サンプルの上にフィルムを折りたたまさないでください。マイクロCTスキャンは、寄生植物の複雑な構造と宿主との相互作用を非破壊の3次元方法でよりよく理解するために活用できます。
ここで説明するプロトコルは、さまざまなマイクロCTシステムで機能します。ただし、設定とパラメーターはシステムとサンプルによって異なります。3D X線顕微鏡画像は、パラサイト宿主界面の組織組織とトポロジーを分析するために、光学顕微鏡で観察された解剖学的切片と同じくらい効果的でした。
造影剤溶液の吸収差による明るい白と濃い灰色の色差に基づいて、吸器の血管コアを取り囲む実質の存在量を観察することができます。血管コアは、2本の血管鎖が実質によって分離されているため、断面で容易に観察されます。多肉植物の宿主植物内で増殖する内部寄生虫Viscum minimumは、デンプンの形で炭水化物を貯蔵する実質細胞を示した。
ヨウ素吸収の違いにより、宿主体内の内部寄生虫によって形成された皮質鎖の複雑なウェブの検出が可能になりました。Cuscuta AmericaaとStruthantus marcianusについて得られた結果は、それぞれ小さなサンプルと大きなサンプルに対するマイクロトモグラフィーアプローチの利便性を説明するのに役立ちます。仮想連続切片シベリウム菌類は、宿主根の血管が寄生虫塊茎に分岐し、2つの植物間の木部連続性が穿孔プレートを介した血管間接続によって形成されることを示しました。
ここで説明する手順は、仮想セグメンテーションなどの他の手法と組み合わせて、寄生植物とその宿主の間の接続の3次元構造に関する新しい洞察を提供できます。この技術は、内部寄生虫の発生や過寄生結合の機能など、寄生植物の生物学のさまざまな側面を分析するための道を開いた。
