O protocolo apresenta diversas técnicas de microscopia aplicadas para compreender a colonização fúngica em plantas micterotróficas, desde a coleta até o preparo de amostras em detalhes e inclua etapas essenciais. Tais técnicas podem ser aplicadas a várias plantas micoheterotróficas, e até mesmo a materiais de uma planta que não sejam micoheterotróficos. Este método está principalmente relacionado à botânica estrutural e também poderia fornecer insights sobre interações micorrizais, fisiologia, biologia reprodutiva, evolução e ecologia de plantas micoheterotróficas.
Para começar, colete as plantas micoheterotróficas explorando o solo ao redor da base vegetal, tomando cuidado para não danificar os órgãos subterrâneos. Além disso, evite retirar as plantas do solo para evitar desconectar os órgãos aéreos dos subterrâneos. Cuidadosamente, cavem em torno de estruturas aéreas usando uma espátula de jardinagem enquanto exploram os órgãos subterrâneos como raízes, caules, rizomas e órgãos de armazenamento sem danificar essas estruturas.
Remova as partículas do solo para preservar estruturas frágeis e lave delicadamente esses órgãos com água da torneira para enxaguar as partículas restantes do solo antes de fixar as amostras. Plantas micoheterotróficas associadas ao lixo de folhas exigem atenção extra. Assim, colecione cuidadosamente os órgãos delicados ligados ao material em decomposição através de sua hifa sem retirá-los das estruturas conectadas.
Preservar estruturas com essas conexões e coletar o lixo para análise. Para análise de microscopia eletrônica de transmissão, se sectionia as amostras de 3 a 4 milímetros de espessura dentro de uma gota de tampão de cacodilato de sódio glutaraldeído em seções menores de 1 a 2 milímetros de espessura. Descarte as bordas de corte fora da gota.
Certifique-se de realizar o processo de fixação no local de coleta imediatamente após a coleta das plantas. Transfira imediatamente as seções para um tubo de coleta com um volume de fixação mais de 10 vezes maior do que o volume das amostras, pois é um fixador aditivo. Para análise superficial da hifa superficial nos órgãos, especialmente nas subterrâneas e em contato com o lixo da folha.
Observe material fresco ou fixo sob o microscópio de dissecção a uma ampliação de 7,5x ou superior. Procure as áreas de interesse guiadas pela hifa superficial e pelos rizomorfos. Selecione as amostras contendo áreas de rizomorfos superficiais, pois estas podem ser seccionadas para visualizar pelotões e bobinas de higiênico dentro de células corticais em raízes e caules.
Prepare 0,2 miligramas por mililitro de germe de trigo aglutinina conjugado fluorocromo e 1%calcofluor de soluções brancas em 0,1 tampão de fosfato molar, conforme descrito no manuscrito do texto. Agora, incubar as seções em lâminas de vidro cobrindo-as adequadamente com germinação de trigo agglutinina fluorocromo solução conjugada por 30 minutos. Após a incubação, lave as seções com tampão de fosfato molar 0,1 e incuba-as na solução de calcofluor como meio de montagem.
Em seguida, coloque os deslizamentos de cobertura nos slides e observe-os sob um microscópio de luz confocal ou fluorescência usando os filtros indicados. Depois de corrigir as amostras, realizar a desidratação e armazená-la em 70% de etanol, exponha qualquer superfície desejada para a análise de microscopia eletrônica de varredura usando uma lâmina afiada e nova para fazer cortes com um movimento unidirecial. Se necessário, use um microscópio estéreo para selecionar as amostras e considerar a área de stubs metálicos, determinando os tamanhos da amostra.
Além disso, desidratar as amostras em uma série etanolica. Mantenha amostras pequenas e delicadas por 30 minutos em cada concentração e amostras maiores e mais densas por 1 hora. Em seguida, dobre pequenos envelopes usando papel de tecido para organizar amostras para os próximos passos.
Amostras maiores podem ser manuseadas sem um envelope. Rotule os envelopes usando um lápis e mantenha um registro das amostras. Com cuidado, coloque as amostras dentro dos envelopes usando um pincel.
Agora, mantenha essas amostras em etanol absoluto. Imediatamente proceda com secagem de pontos críticos operando uma secadora de ponto crítico de acordo com os procedimentos operacionais padrão. Para isso, coloque as amostras em etanol absoluto em um suporte de amostra e coloque-a dentro da câmara de pressão do ponto crítico.
O fluido intermediário dissolve-se no fluido de transição no ponto crítico de dióxido de carbono, secando assim as amostras. Como a reabsorção da umidade atmosférica pode destruir as amostras, armazene-as em um recipiente de dessecação imediatamente após a secagem de pontos críticos. Antes de montar as amostras em estações metálicas, coloque as luvas para manipular os stubs.
Mergulhe-os em acetona por 5 minutos para eliminar qualquer gordura e deixá-los secar. Sob um microscópio estéreo, fixar as amostras no stub usando uma fita adesiva de carbono de dois lados condutor e posicioná-las. O local de cima é a única perspectiva possível na varredura de imagens de microscopia eletrônica.
Para manipular as amostras, use pinças de ponta fina. A parte da amostra tocada pelas pinças é geralmente danificada. Por isso, tenha cuidado e tente tocar peças posicionadas longe das áreas de interesse.
Mantenha os stubs com amostras em uma placa de Petri selada com gel de sílica. Em seguida, prossiga com o revestimento de sputter para depositar uma camada de ouro ou platina na superfície das amostras em uma atmosfera de baixa pressão de gás inerte seguindo os procedimentos operacionais padrão. A espessura do revestimento depende da topografia da amostra e geralmente está entre 15 a 40 nanômetros.
Por fim, mantenha os stubs revestidos em uma placa de Petri selada com gel de sílica mantendo a umidade. As amostras podem ser armazenadas desta forma por semanas. Use um microscópio eletrônico de varredura para analisar essas amostras.
Um feixe de elétrons atinge a amostra de vacuo durante a microscopia eletrônica de varredura e a emissão de sinal de tal interação é interpretada como imagens. Certifique-se de que as soluções e materiais utilizados na germinação simbiótica das sementes sejam estéreis. para evitar contaminação.
Comece autoclavando-os por 20 minutos a 121 graus Celsius. Em uma capa de fluxo de ar laminar, desinfete superficialmente as frutas e sementes imergindo-as em uma solução de hipoclorito de sódio contendo cloro 2% ativo. Sementes finas e frágeis podem ser imersas em uma solução de hipoclorito de sódio diluído 1:1.
Após a desinfecção, recupere as sementes filtrando-as usando tecido xerográfico. Lave os frutos e sementes três vezes em água destilada autoclavada para remover a solução de hipoclorito antes de prosseguir com os testes de germinação. Se necessário, armazene-os em envelopes de papel filtro dentro de frascos de vidro com gel de sílica a 4 graus Celsius e feche hermeticamente os frascos e sele-os com filme agarrado, em seguida, avalie a eficácia do processo de lavagem transferindo algumas gotas de água da última lavagem para o ágar de dextrose de batata.
Para germinação simbiótica de sementes de orquídeas, incubar as sementes com mais de 1 a 2 centímetros de papel de papel filtro autoclavado colocados em pratos de Petri contendo meio de cultura de ágar de aveia. Agora, inocular o centro da placa de Petri com o fragmento do meio de cultura contendo micélio do fungo isolado escolhido. Sele as placas de Petri com filme agarrado e incuba-as no escuro a cerca de 25 graus Celsius ou temperatura ambiente, dependendo do crescimento fúngico.
Prepare alguns pratos com sementes e sem inoculação fúngica como um controle negativo para o teste de germinação. Analisar os resultados da germinação semanalmente coletando dados quantitativos e qualitativos e fotografando protocorms e mudas. Os rizomófos podem ser facilmente reconhecidos geralmente como estruturas escuras, semelhantes a sapatos.
À mão livre ou outros métodos de obtenção de seções mais grossas que 10 micrômetros podem evidenciar melhor pelotões e fornecer imagens mais representativas de padrões fúngicos de colonização. Seções à mão livre também podem ser adequadas para análise de hifa em maior amplificação. Embora, os detalhes sejam melhor alcançados em seções mais finas.
As paredes de células secundárias em elementos xilema podem ser facilmente identificadas pela cor clara que toluidina adquire. Enquanto isso, elementos de phloem compostos apenas de paredes celulares primárias são identificados por suas paredes celulares mais finas e escuras. Artefatos por autofluorescência podem ser vistos em seções de resina de metacrilato glicol.
Estes artefatos geralmente estão relacionados à concentração fluorocromática e podem ser evitados lavando as amostras um número maior de vezes com o tampão. A seção à mão livre da raiz mostra hifas internas e externas. O mesmo órgão pode ser visto através da microscopia eletrônica com uma abundância de rizomorfos e hifas individuais em sua superfície.
A maioria das espécies de orquídeas germinam dentro de algumas semanas depois de serem infectadas pelo fungo inoculado ou até quase mais de um mês. A luz na microscopia eletrônica de varredura pode ser aplicada em flores, frutas e sementes para investigar a biologia reprodutiva ou plantas micoheterotróficas. A germinação simbiótica das sementes também pode ser testada em orquídeas autotróficas.
