El protocolo presenta diversas técnicas de microscopía aplicadas para comprender la colonización fúngica en plantas micoheterótrofas, desde la recolección hasta la preparación de muestras en detalle e incluyen pasos esenciales. Tales técnicas se pueden aplicar a varias plantas micoheterótrofas, e incluso a materiales de una planta que no sean micoheterótrofos. Este método está relacionado principalmente con la botánica estructural y también podría proporcionar información sobre las interacciones micorrízicas, la fisiología, la biología reproductiva, la evolución y la ecología de las plantas micoheterótrofas.
Para comenzar, recolecte las plantas micoheterótrofas explorando el suelo alrededor de la base de la planta, teniendo cuidado de no dañar los órganos subterráneos. Además, evita tirar de las plantas del suelo para evitar desconectar los órganos aéreos de los subterráneos. Con cuidado, cava alrededor de las estructuras aéreas usando una paleta de jardinería mientras exploras los órganos subterráneos como raíces, tallos, rizomas y órganos de almacenamiento sin dañar estas estructuras.
Retire las partículas de tierra para preservar las estructuras frágiles y lave delicadamente estos órganos con agua del grifo para enjuagar las partículas restantes del suelo antes de fijar las muestras. Las plantas micoheterótrofas asociadas con la hojarasca exigen atención adicional. Por lo tanto, recoja cuidadosamente los delicados órganos conectados al material en descomposición a través de sus hifas sin tirar de ellos de las estructuras conectadas.
Conserve las estructuras con tales conexiones y recoja la basura para su análisis. Para el análisis de microscopía electrónica de transmisión, divida las muestras de 3 a 4 milímetros de espesor dentro de una gota de tampón de cacodilato de sodio de glutaraldehído en secciones más pequeñas de 1 a 2 milímetros de espesor. Deseche los bordes cortados fuera de la gota.
Asegúrese de llevar a cabo el proceso de fijación en el sitio de recolección inmediatamente después de la recolección de las plantas. Transfiera inmediatamente las secciones a un tubo de recolección con un volumen de fijador más de 10 veces mayor que el volumen de las muestras, ya que es un fijador aditivo. Para el análisis superficial de las hifas superficiales en los órganos, especialmente en los subterráneos y aquellos en contacto con la hojarasca.
Observe material fresco o fijo bajo el microscopio de disección con un aumento de 7,5x o más. Búsqueda de las áreas de interés guiada por las hifas superficiales y los rizomorfos. Seleccione las muestras que contienen áreas de rizomorfos superficiales, ya que se pueden seccionar para visualizar pelotones y bobinas de hifas dentro de las células corticales en raíces y tallos.
Prepare 0,2 miligramos por mililitro de conjugado de fluorocromo de aglutinina de germen de trigo y soluciones blancas de calcofluor al 1% en tampón fosfato molar al 0,1 como se describe en el texto manuscrito. Ahora, incube las secciones en portaobjetos de vidrio cubriéndolas adecuadamente con una solución conjugada de fluorocromo de aglutinina de germen de trigo durante 30 minutos. Después de la incubación, lavar las secciones con tampón fosfato molar 0,1 e incubarlas en la solución de calcofluor como medio de montaje.
A continuación, coloque los cubreobjetos en los portaobjetos y obsérvelo bajo un microscopio de luz confocal o fluorescente utilizando los filtros indicados. Después de fijar las muestras, realizar la deshidratación y almacenarlas en etanol al 70%, exponga cualquier superficie deseada para el análisis de microscopía electrónica de barrido utilizando una cuchilla de afeitar afilada y nueva para hacer cortes con un movimiento unidireccional. Si es necesario, use un microscopio estereoscópico para seleccionar las muestras y considere el área de los talones metálicos mientras determina los tamaños de las muestras.
Además, deshidratar las muestras en una serie etanólica. Mantenga muestras pequeñas y delicadas durante 30 minutos en cada concentración y muestras más grandes y densas durante 1 hora. A continuación, doble los sobres pequeños con papel de seda para organizar las muestras para los siguientes pasos.
Las muestras más grandes se pueden manipular sin un sobre. Etiquete los sobres con un lápiz y mantenga un registro de las muestras. Con cuidado, coloque las muestras dentro de los sobres con un pincel.
Ahora, mantenga estas muestras en etanol absoluto. Proceda inmediatamente con el secado de puntos críticos operando un secador de puntos críticos de acuerdo con los procedimientos operativos estándar. Para ello, coloque las muestras en etanol absoluto en un portamuestras y colóquelas dentro de la cámara de presión del secador de punto crítico.
El fluido intermedio se disuelve en el fluido de transición en el punto crítico de dióxido de carbono, secando así las muestras. Como la reabsorción de la humedad atmosférica puede destruir las muestras, guárdelas en un recipiente de desecación inmediatamente después del secado del punto crítico. Antes de montar las muestras en talones de metal, póngase los guantes para manipular los talones.
Sumérgelas en acetona durante 5 minutos para eliminar cualquier grasa y déjalas secar. Bajo un microscopio estéreo, fije las muestras en el talón con una cinta adhesiva de carbono conductora de doble cara y colóquelas. El sitio desde arriba es la única perspectiva posible en las imágenes de microscopía electrónica de barrido.
Para manipular las muestras, utilice pinzas de punta fina. La parte de la muestra tocada por las pinzas generalmente está dañada. Así que tenga cuidado e intente tocar las partes colocadas lejos de las áreas de interés.
Mantenga los talones con muestras en una placa de Petri sellada con gel de sílice. A continuación, proceda con el recubrimiento por pulverización catódica para depositar una capa de oro o platino en la superficie de las muestras en una atmósfera de baja presión de gas inerte siguiendo los procedimientos operativos estándar. El espesor del recubrimiento depende de la topografía de la muestra y suele estar entre 15 y 40 nanómetros.
Finalmente, mantenga los talones recubiertos en una placa de Petri sellada con gel de sílice que retenga la humedad. Las muestras se pueden almacenar de esta manera durante semanas. Utilice un microscopio electrónico de barrido para analizar estas muestras.
Un haz de electrones golpea la muestra en vacío durante la microscopía electrónica de barrido y la emisión de señal de dicha interacción se interpreta como imágenes. Asegúrese de que las soluciones y materiales utilizados en la germinación simbiótica de las semillas sean estériles. para evitar la contaminación.
Comience por esterilizarlos en autoclave durante 20 minutos a 121 grados centígrados. En una campana de flujo de aire laminar, desinfecte superficialmente las frutas y semillas sumergiéndolas en una solución de hipoclorito de sodio que contenga 2% de cloro activo. Las semillas delgadas y frágiles se pueden sumergir en una solución diluida de hipoclorito de sodio 1:1.
Después de la desinfección recuperar las semillas filtrándolas con tejido xerográfico. Lave las frutas y semillas tres veces en agua destilada esterilizada en autoclave para eliminar la solución de hipoclorito antes de proceder con las pruebas de germinación. Si es necesario, guárdelos en sobres de papel de filtro dentro de matraces de vidrio con gel de sílice a 4 grados centígrados y cierre herméticamente los matraces y séllelos con película adhesiva, luego evalúe la efectividad del proceso de lavado transfiriendo algunas gotas de agua del último lavado al agar dextrosa de papa.
Para la germinación simbiótica de las semillas de orquídeas, incubar las semillas sobre discos de papel de filtro esterilizados en autoclave de 1 a 2 centímetros colocados en placas de Petri que contienen medio de cultivo de agar avena. Ahora, inocular el centro de la placa de Petri con el fragmento de medio de cultivo que contiene micelio del hongo aislado elegido. Selle las placas de Petri con película adhesiva e incubarlas en la oscuridad a unos 25 grados centígrados o temperatura ambiente, dependiendo del crecimiento de hongos.
Preparar algunos platos con semillas y sin inoculación fúngica como control negativo para la prueba de germinación. Analice los resultados de germinación semanalmente mediante la recopilación de datos cuantitativos y cualitativos y la fotografía de protocormos y plántulas. Los rizomorfos se pueden reconocer fácilmente generalmente como estructuras oscuras, similares a cordones.
A mano alzada u otros métodos para obtener secciones de más de 10 micrómetros de espesor pueden evidenciar mejor los pelotones y proporcionar imágenes más representativas de los patrones fúngicos de colonización. Las secciones a mano alzada también pueden ser adecuadas para el análisis de hifas en amplificación más alta. Aunque, los detalles se logran mejor en secciones más delgadas.
Las paredes celulares secundarias en los elementos del xilema se pueden identificar fácilmente por el color claro que adquiere la toluidina. Mientras tanto, los elementos del floema compuestos solo de paredes celulares primarias se identifican por sus paredes celulares más delgadas y oscuras. Los artefactos por autofluorescencia se pueden ver en secciones de resina de metacrilato de glicol.
Estos artefactos generalmente están relacionados con la concentración de fluorocromo y se pueden evitar lavando las muestras un mayor número de veces con el tampón. La sección a mano alzada de la raíz muestra hifas internas y externas. El mismo órgano se puede ver mediante microscopía electrónica de barrido con una gran cantidad de rizomorfos e hifas individuales en su superficie.
La mayoría de las especies de orquídeas germinan dentro de algunas semanas después de haber sido infectadas por el hongo inoculado o hasta casi más de un mes. La luz en la microscopía electrónica de barrido se puede aplicar a flores, frutas y semillas para investigar la biología reproductiva o las plantas micoheterótrofas. La germinación simbiótica de las semillas también se puede probar en orquídeas autótrofas.
