يقدم البروتوكول تقنيات الفحص المجهري المتنوعة المطبقة لفهم الاستعمار الفطري في النباتات المتغايرة ، من الجمع إلى إعداد العينات بالتفصيل وتشمل الخطوات الأساسية. يمكن تطبيق هذه التقنيات على مختلف النباتات المتغايرة ، وحتى على مواد النبات بخلاف المتغايرات المتغايرة. ترتبط هذه الطريقة بشكل أساسي بعلم النبات الهيكلي ويمكن أن توفر أيضا رؤى ثاقبة حول التفاعلات الفطرية ، وعلم وظائف الأعضاء ، والبيولوجيا الإنجابية ، والتطور ، والبيئة للنباتات المتغايرة للفطريات.
للبدء ، قم بجمع النباتات المتغايرة من خلال استكشاف التربة حول قاعدة النبات ، مع الحرص على عدم إتلاف الأعضاء تحت الأرض. أيضا ، تجنب سحب النباتات من الأرض لمنع فصل الأعضاء الهوائية عن الأعضاء الجوفية. بعناية ، قم بالحفر حول الهياكل الهوائية باستخدام مجرفة البستنة أثناء استكشاف الأعضاء الجوفية مثل الجذور والسيقان والجذور وأجهزة التخزين دون الإضرار بهذه الهياكل.
قم بإزالة جزيئات التربة للحفاظ على الهياكل الهشة وغسل هذه الأعضاء بدقة بماء الصنبور لشطف جزيئات التربة المتبقية قبل تثبيت العينات. تتطلب النباتات المتغايرة المرتبطة بفضلات الأوراق مزيدا من الاهتمام. وبالتالي ، قم بجمع الأعضاء الحساسة المتصلة بالمواد المتحللة بعناية من خلال hyphae دون سحبها من الهياكل المتصلة.
الحفاظ على الهياكل مع مثل هذه الاتصالات وجمع القمامة للتحليل. لتحليل المجهر الإلكتروني الناقل ، قسم العينات التي يتراوح سمكها من 3 إلى 4 ملليمترات داخل قطرة من الغلوتارالدهيد الصوديوم كاكوديليت المخزن المؤقت إلى أقسام أصغر من 1 إلى 2 ملليمتر. تخلص من الحواف المقطوعة خارج القطرة.
تأكد من إجراء عملية التثبيت في موقع التجميع مباشرة بعد جمع النباتات. انقل المقاطع على الفور إلى أنبوب تجميع بحجم مثبت أكبر بأكثر من 10 مرات من حجم العينات لأنه مثبت مضاف. للتحليل السطحي للضجيج السطحي في الأعضاء ، وخاصة في الأعضاء الجوفية وتلك التي تتلامس مع فضلات الأوراق.
راقب المواد الطازجة أو الثابتة تحت المجهر التشريحي عند تكبير 7.5x أو أعلى. ابحث عن مجالات الاهتمام التي تسترشد بها hyphae السطحية و rhizomorphs. حدد العينات التي تحتوي على مناطق من الريزومورفات السطحية حيث يمكن تقسيمها لتصور بيلوتون ولفائف hyphae داخل الخلايا القشرية في الجذور والسيقان.
تحضير 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر من فلوروكروم جرثومة القمح المترافقة و 1٪ من المحاليل البيضاء calcofluor في 0.1 مخزن فوسفات مولي كما هو موضح في مخطوطة النص. الآن ، احتضن الأقسام الموجودة على الشرائح الزجاجية عن طريق تغطيتها بشكل صحيح بمحلول اقتران فلوروكروم جرثومة القمح لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الأقسام بمخزن مؤقت للفوسفات المولي 0.1 واحتضنها في محلول calcofluor كوسيط تركيب.
بعد ذلك ، ضع زلات الغطاء على الشرائح وراقبها تحت مجهر ضوئي متحد البؤرة أو التألق باستخدام المرشحات المشار إليها. بعد تثبيت العينات ، وإجراء الجفاف ، وتخزينها في 70٪ من الإيثانول ، قم بتعريض أي سطح مرغوب فيه لمسح التحليل المجهري الإلكتروني باستخدام شفرة حلاقة حادة وجديدة لإجراء تخفيضات بحركة أحادية الاتجاه. إذا لزم الأمر ، استخدم مجهر ستيريو لاختيار العينات والنظر في منطقة الكعب المعدني أثناء تحديد أحجام العينات.
علاوة على ذلك ، جفف العينات في سلسلة إيثانوليك. الحفاظ على عينات صغيرة وحساسة لمدة 30 دقيقة في كل تركيز وعينات أكبر وأكثر كثافة لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، قم بطي المغلفات الصغيرة باستخدام المناديل الورقية لتنظيم العينات للخطوات التالية.
يمكن التعامل مع العينات الأكبر حجما بدون ظرف. قم بتسمية المغلفات باستخدام قلم رصاص واحتفظ بسجل للعينات. بعناية ، ضع العينات داخل المغلفات باستخدام فرشاة الطلاء.
الآن ، احتفظ بهذه العينات في الإيثانول المطلق. تابع على الفور تجفيف النقاط الحرجة من خلال تشغيل مجفف النقاط الحرجة وفقا لإجراءات التشغيل القياسية. لهذا ، ضع العينات في الإيثانول المطلق في حامل العينة وضعها داخل غرفة ضغط مجفف النقطة الحرجة.
يذوب السائل الوسيط في السائل الانتقالي عند نقطة ثاني أكسيد الكربون الحرجة ، وبالتالي تجفيف العينات. نظرا لأن إعادة امتصاص الرطوبة الجوية يمكن أن تدمر العينات ، فقم بتخزينها في حاوية تجفيف مباشرة بعد تجفيف النقطة الحرجة. قبل تركيب العينات على الكعب المعدني ، ضع القفازات للتلاعب بالكعب.
اغمرها في الأسيتون لمدة 5 دقائق للتخلص من أي دهون واتركها تجف. تحت مجهر ستيريو ، قم بإصلاح العينات الموجودة على الكعب باستخدام شريط لاصق كربوني موصل على الوجهين ووضعها. الموقع من الأعلى هو المنظور الوحيد الممكن في مسح صور المجهر الإلكتروني.
لمعالجة العينات، استخدم ملاقط النقاط الدقيقة. عادة ما يكون جزء العينة الذي تلمسه الملقط تالفا. لذا كن حذرا وحاول لمس الأجزاء الموضوعة بعيدا عن مجالات الاهتمام.
الحفاظ على الكعب مع عينات في طبق بتري مختوم مع هلام السيليكا. بعد ذلك ، تابع طلاء الرذاذ لإيداع طبقة من الذهب أو البلاتين على سطح العينات في جو منخفض الضغط من الغاز الخامل باتباع إجراءات التشغيل القياسية. يعتمد سمك الطلاء على تضاريس العينة وعادة ما يتراوح بين 15 إلى 40 نانومتر.
أخيرا ، حافظ على الكعوب المطلية في طبق بتري مغلق مع هلام السيليكا الذي يحتفظ بالرطوبة. يمكن تخزين العينات بهذه الطريقة لأسابيع. استخدم المجهر الإلكتروني الماسح لتحليل هذه العينات.
يضرب شعاع الإلكترون العينة في الفراغ أثناء المسح المجهري الإلكتروني ويتم تفسير انبعاث الإشارة من هذا التفاعل على أنه صور. تأكد من أن المحاليل والمواد المستخدمة في الإنبات التكافلي للبذور معقمة. لتجنب التلوث.
ابدأ بتعقيمها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية. في غطاء تدفق الهواء الرقائقي ، قم بتطهير الثمار والبذور بشكل سطحي عن طريق غمرها في محلول هيبوكلوريت الصوديوم الذي يحتوي على 2٪ من الكلور النشط. يمكن غمر البذور الرفيعة والهشة في محلول هيبوكلوريت الصوديوم المخفف 1: 1.
بعد التطهير ، استعيد البذور عن طريق تصفيتها باستخدام نسيج زيروغرافي. اغسل الثمار والبذور ثلاث مرات في ماء مقطر معقم لإزالة محلول هيبوكلوريت قبل الشروع في اختبارات الإنبات. إذا لزم الأمر ، قم بتخزينها في مظاريف ورق ترشيح داخل قوارير زجاجية مع هلام السيليكا عند 4 درجات مئوية وأغلق القوارير بإحكام وأغلقها بفيلم التشبث ، ثم قم بتقييم فعالية عملية الغسيل عن طريق نقل بعض قطرات الماء من الغسيل الأخير إلى أجار سكر العنب البطاطس.
للإنبات التكافلي لبذور السحلية ، احتضن البذور التي تزيد عن 1 إلى 2 سم من أقراص ورق الترشيح المعقمة الموضوعة في أطباق بتري التي تحتوي على وسط ثقافة أجار الشوفان. الآن ، قم بتلقيح مركز طبق بتري بجزء من وسط الثقافة الذي يحتوي على الميسيليوم من الفطريات المعزولة المختارة. قم بإغلاق أطباق بتري بفيلم التشبث واحتضنها في الظلام عند حوالي 25 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة ، اعتمادا على نمو الفطريات.
تحضير بعض الأطباق بالبذور وبدون تلقيح فطري كعنصر تحكم سلبي لاختبار الإنبات. تحليل نتائج الإنبات أسبوعيا من خلال جمع البيانات الكمية والنوعية وتصوير البروتوكورمات والشتلات. يمكن التعرف بسهولة على الريزومورفات عادة كهياكل مظلمة تشبه الأحذية.
يمكن لليد الحرة أو غيرها من الطرق للحصول على أقسام أكثر سمكا من 10 ميكرومتر أن تظهر بشكل أفضل البيلوزونات وتوفر صورا أكثر تمثيلا للأنماط الفطرية للاستعمار. يمكن أن تكون الأقسام اليدوية أيضا مناسبة لتحليل hyphae في تضخيم أعلى. على الرغم من أن التفاصيل يتم تحقيقها بشكل أفضل في أقسام أرق.
يمكن التعرف بسهولة على جدران الخلايا الثانوية في عناصر xylem من خلال اللون الفاتح الذي يكتسبه التولويدين . وفي الوقت نفسه ، يتم تحديد عناصر اللحاء المكونة فقط من جدران الخلايا الأولية من خلال جدران الخلايا الأرق والأكثر قتامة. يمكن رؤية القطع الأثرية بواسطة التألق الذاتي في أقسام راتنج الميثاكريليت غليكول.
عادة ما ترتبط هذه القطع الأثرية بتركيز الفلوروكروم ويمكن تجنبها عن طريق غسل العينات لعدد أكبر من المرات باستخدام المخزن المؤقت. يظهر القسم الحر من الجذر hyphae الداخلية والخارجية. يمكن رؤية نفس العضو عن طريق مسح المجهر الإلكتروني مع وفرة من الريزومورفات و hyphae الفردية على سطحه.
تنبت معظم أنواع بساتين الفاكهة في غضون بضعة أسابيع بعد إصابتها بالفطريات الملقحة أو حتى ما يقرب من أكثر من شهر. يمكن تطبيق الضوء في المجهر الإلكتروني الماسح على الزهور والفواكه والبذور للتحقيق في البيولوجيا التناسلية أو النباتات المتغايرة الفطرية. يمكن أيضا اختبار الإنبات التكافلي للبذور في بساتين الفاكهة ذاتية التغذية.
