このプロトコルを使用してアクチンの挙動を調査することは、ユーザーが光学トラップの精度を使用してモータータンパク質アンサンブルダイナミクスを調査できるため、重要です。この技術の主な利点は、多くの光トラップ実験で使用される従来の単一モーター単一フィラメント配向とは対照的に、アクチン構造階層内のミオシン力学を測定できることです。このプロトコルのもう一つの利点は、ユーザーが選択した階層的な細胞骨格システムに合わせてアッセイをカスタマイズできるモジュラー性です。
まず、顕微鏡スライドの中央に2枚の両面粘着テープを3〜4ミリメートル離して貼り付けます。次に、スライドの端からぶら下がっている余分なテープを引き裂くか切り取ります。次に、顕微鏡スライドの長軸に垂直なテープの上にPLLコーティングされたカバースリップを追加して、チャネルを形成します。
小さなチューブを使用してカバースリップをテープと顕微鏡に圧縮し、テープが透明になるまで完全にスライドさせ、流路からの漏れの原因となる可能性があるため、テープに気泡がないことを確認します。15マイクロリットルの希釈ローダミンアクチンをPLLフローセルに加え、余分な溶液をフローセルに通しますが、流路が乾かないようにしてください。その後、湿度チャンバー内で10分間インキュベートします。
次に、アクチン重合緩衝液中の1ミリリットル当たり1ミリグラムのカゼイン溶液を調製し、その後の成分の非特異的結合を防ぐために15マイクロリットルの溶液を加える。その後、湿度チャンバー内で5分間インキュベートします。その後、調製したビオチン化アクチンとビーズ懸濁液に希望濃度のミオシンを加え、ピペットチップで穏やかに攪拌します。
次に、直ちに15マイクロリットルの懸濁液を所望のミオシン濃度と共にフローセルに加え、20分間インキュベートする。次に、フローセルの開放端をマニキュアで密封して、イメージングおよび光学トラップ実験中の蒸発を防ぎます。システムの準備ができたら、画面の左下隅にあるレーザーパワーボタンを使用してレーザーを50ミリワットまでオンにし、30分間安定させます。
ソフトウェア内の照明、カメラ、対物レンズ、ステージ移動ボタンを順番にクリックすると、実験中に表示および操作できるウィンドウが表示されます。オン/オフボタンをクリックして顕微鏡照明をオンにし、バーをクリックして右端までドラッグして最大出力に設定します。サンプル領域を開き、顕微鏡ステージからサンプルホルダーを取り外します。
次に、フローセルを追加し、金属サンプルホルダーで固定し、カバースリップが底にあることを確認します。その後、下部対物レンズの中央に30マイクロリットルのRO水を加え、サンプルステージを再挿入します。次に、水のビーズがカバースリップに触れるまで、リモコンのL2を使用して下部の対物レンズを上げます。
次に、リモコンのR2を使用して、フローセルまでの距離の約半分に達するまで上部の目標を下げます。次に、上部対物レンズの真下のフローセルの上部に170マイクロリットルのRO水を追加し、水の表面張力が壊れてメニスカスを形成するまで上部対物レンズを下げます。続いて、リモコンの矢印パッドを使用して顕微鏡ステージを流路に隣接するテープの端に達するまで移動し、サンプルドアを閉じます。
画面の対物レンズウィンドウを使用して、上の矢印をクリックして「レーザー対物レンズ」という名前の下部の対物レンズを上に、画面上のコントロールを使用して下の矢印をクリックして上部の対物レンズを上に表示して、テープの端とフォーカスを合わせます。フローティングビーズを見つけてトラップシャッターボタンをクリックしてトラップすると、シャッターが開き、トラップレーザーがサンプルに当たることができます。次に、画面上のトラップカーソルをクリックしてドラッグし、トラップレーザーの位置を移動します。
トラップしたら、キャリブレーションボタンをクリックしてビードをキャリブレーションします。次に、[設定]をクリックして、ソフトウェアウィンドウの左下にあるビードの直径とステージの温度を入力します。次に、トラップ1をクリックし、次にX信号をクリックし、実行をクリックしてコーナー周波数フィットを実行します。
次に、ウィンドウ内をクリックしてドラッグし、機能のフィットを最適化します。その後、[感度と剛性の値に使用する]をクリックしてから、値を受け入れます。続いて、ウィンドウを閉じます。
カバースリップの表面でAFに結合したビーズを検索し、共局在した両方の蛍光AFを探すことにより、アクトミオシンバンドルを見つけます。白色光源をオンにし、適切なフィルターキューブを使用して、タレットを回して各アクチンフィラメントをイメージングします。確認したら、トラップシャッターボタンをクリックして、バンドルの上部フィラメントに取り付けられたビードをトラップします。
次に、オンスクリーンコントロールを使用してオシロスコープボタンをクリックしてデータを記録します。データを記録せずに測定値を視覚化するには、[開始]をクリックし、[自動保存]をクリックしてすべてのデータを保存します。測定値を記録するには、[記録の開始]をクリックし、ドロップダウンメニューの[X信号]または[Y信号]を選択して、リアルタイムで視覚化するデータを選択します。
構築されたin vitroアクチン構造階層内で力を生成する骨格ミオシンモーターの力の痕跡は、2〜5分にわたってプラトーに達するまで、力の安定したランプを示します。ただし、正味の力と力の痕跡を発生しない一部のアクトミオシンバンドルは、ベースラインノイズとして現れるか、モーターの濃度が低いか、フィラメントの平行方向が悪いために、90秒にわたって力の実質的な正味の増加を示さないことも観察されます。このプロトコル開発は、細胞分裂や筋肉収縮などの大規模な細胞タスクのボトムアップモデリングにさらに役立つ、より複雑なin vitro細胞骨格アッセイの構築への道を開きます。
