このアッセイ方法論は、血液期のマラリアに対する細胞免疫の知識における大きな進歩であり、新しい治療標的の発見とマラリアワクチンの進歩の加速に役立ちます。ヒトまたは動物のサンプルに使用できるマラリア原虫インビトロアッセイの確立は、マラリアの病因をよりよく理解するために価値があります。マラリア防御免疫は完全には理解されていません。
新しい治療法の開発には、マラリア寄生期に対する細胞免疫のメカニズムを探ることが不可欠です。手順を実演するのは、私、ルナ・デ・ラセルダ、そしてキャロラインの研究室の学部生であるクリストファー・ゴメスです。はじめに、100マイクロリットルのヘパリン溶液を26ゲージの針で1ミリリットルの注射器に吸引します。
マウスを横に置き、針を肘のすぐ下、肋骨を通して心臓に垂直に挿入します。シリンジプランジャーをゆっくりと引き出し、0.5〜1ミリリットルの血液が得られるまで針を回転させます。マウスの左側を70%エタノールで無菌的に洗浄します。
外科用ハサミで、マウスの左側に切り込みを入れ、皮膚と腹膜を通過させます。脾臓を見つけて取り除きます。マウスの脾臓を5ミリリットルの完全培地と共にシャーレに入れて、所望のエフェクター細胞集団を精製する。
100マイクロモルのセルストレーナーを50ミリリットルのコニカルチューブの上に置き、解剖学的鉗子を使用して摘出した脾臓をセルストレーナーに移します。シリンジプランジャーでストレーナーを通して脾臓をマッシュアップします。10ミリリットルの完全培地でストレーナーを通して細胞を洗浄します。
細胞を300 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。その後、上清を廃棄する。細胞ペレットを2ミリリットルの冷赤血球溶解バッファーに再懸濁し、懸濁液を氷上で5分間インキュベートします。
細胞懸濁液を10ミリリットルの摂氏4度の完全な培地で洗浄し、マラリア原虫に感染したマウスの脾臓の洗浄の間に細胞血栓を取り除きます。細胞を400 Gで4°Cで5分間遠心分離します。その後、上清を廃棄する。
次に、LSまたはLDカラムを磁場に入れ、3ミリリットルのMACSバッファーですすいでカラムを準備します。次に、細胞懸濁液をカラムに塗布します。カラムを3ミリリットルのMACSバッファーで3回洗浄した後、脾細胞を含むフロースルーを回収する。
10マイクロリットルの脾細胞を収穫し、10マイクロリットルのトリパンブルーを加えて細胞の生存率を確認します。細胞を血球計算盤に加える。トリパンブルー溶液中の脾細胞を数え、細胞の生存率を確認します。
すべての脾細胞を遠心分離し、上清を廃棄します。細胞ペレットを40マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。10マイクロリットルのビオチン抗体カクテルを細胞に加え、よく混ぜ合わせて、氷上で5分間インキュベートします。
抗ビオチンマイクロビーズを氷上で10分間インキュベートした後、MACS LSカラムを磁場支持体に入れ、3ミリリットルのMACSバッファーですすいでカラムを準備します。細胞懸濁液をカラムに塗布します。カラムを3ミリリットルのMACSバッファーで3回洗浄し、すべての非標識細胞傷害性細胞を含むフロースルーを回収します。
採取した血液を350倍Gで5分間遠心分離した後、血清を廃棄し、FBSなしで1ミリリットルのRPMIに血液を再懸濁します。LSカラムを磁場サポートに入れた後、RPMIですすぎ、RBC懸濁液をカラムに通します。細胞がカラムを通過したら、フロースルーを遠心分離し、上清を廃棄し、1ミリリットルのフロースルーをカラムに再塗布して、さらにiRBCを単離します。
カラムを5ミリリットルのRPMIで2回洗浄します。カラムリザーバーが空になったらすぐにバッファーアリコートを添加して洗浄ステップを実行します。5ミリリットルのRPMIを追加し、カラムを取り外して、iRBCをパージして新しい15ミリリットルのチューブに入れます。
1マイクロリットルの10ミリモルCFSE溶液をFBSを含まない1ミリリットルのRPMIで希釈します。FBSを含まない500ミリリットルのRPMIにRBCを再懸濁した後、500ミリリットルの希釈CFSEを加え、光から保護された室温で8分間インキュベートします。細胞を14ミリリットルの完全培地で3回洗浄し、細胞を2回遠心分離します。
細胞傷害性リンパ球共培養の場合は、細胞を96ウェル丸底プレートにプレートします。精製リンパ球とCFSE標識iRBCを所望のエフェクター/標的細胞比で最終容量200ミリリットルまで添加し、ホモジナイズします。各条件を三重に準備し、摂氏37度で細胞をインキュベートします。
iRBCは、LSカラムを用いてP.yoelii感染マウスから精製した。精製は、カラム濃縮の前後に採取された血液からの血液塗抹標本によって強調されます。赤血球溶解の割合を評価するために必要なゲーティング戦略をここに示します。
停止ゲートは、カウントビーズの母集団に設定されます。ゲーティング戦略は、前方散乱ピークの高さ対面積比に基づいて、破片を除く単一細胞を選択することから開始され、続いてTer119+およびCD8の赤血球集団を選択し、次に、生きたIBCをCFSE高陽性として選択します。これは、異なるエフェクター対ターゲット比を使用した実験例に適用された分析であり、共培養後の生きた赤血球を表示します。
この式に基づいて計算された赤血球溶解率のグラフ表示が表示されます。細胞傷害性CD8またはナイーブCD8を用いた群間の有意性は、多重比較を伴う二元配置分散分析によって評価された。現在の方法では、キラー細胞との直接的な細胞接触による赤血球溶解を探索し、特定の受容体または分子に対するブロッキング抗体を使用して関与するメカニズムを明らかにすることを計画できます。
このin vitro kill assayは、血液期マラリアに対する細胞性免疫のメカニズムを明らかにするための新しい戦略を提示し、新しいマラリア治療とワクチンの進歩に役立ちます。
