Esta metodologia de ensaio, é um grande avanço no conhecimento da imunidade celular contra a malária em estágio sanguíneo, ajudando a descobrir novos alvos terapêuticos e a acelerar o progresso da vacina contra a malária. O estabelecimento de um ensaio in vitro de plasmódio que possa ser usado para amostras humanas ou animais é valioso para uma melhor compreensão da patogênese da malária. A imunidade protetora contra a malária não é completamente compreendida.
Para o desenvolvimento de novas terapias, é essencial explorar mecanismos de imunidade celular à fase parasitária da malária. Quem demonstrará o procedimento serão eu, Luna de Lacerda e Christopher Gomes, aluno de graduação do laboratório de Caroline. Para começar, aspirar 100 microlitros de solução de heparina em uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 26.
Coloque o rato de lado e introduza perpendicularmente a agulha logo abaixo do cotovelo, através das costelas e no coração. Puxe o êmbolo da seringa lentamente e gire a agulha até obter 0,5 a um mililitro de sangue. Limpe assepticamente o lado esquerdo do rato com etanol a 70%.
Com tesoura cirúrgica, faça um corte no lado esquerdo do rato, passando pela pele e peritônio. Localize o baço e remova-o. Coloque o baço de camundongo em uma placa de Petri com cinco mililitros de meio completo para purificar a população de células efetoras desejada.
Coloque um filtro de células de 100 micromolares sobre um tubo cônico de 50 mililitros e transfira o baço excisado para o filtro de células usando pinças anatômicas. Amasse o baço através do coador com um êmbolo de seringa. Lave as células através do filtro com 10 mililitros de mídia completa.
Centrifugar as células a 300 G durante 10 minutos a quatro graus centígrados. Em seguida, descarte o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em dois mililitros de tampão de lise RBC frio e incubar a suspensão por cinco minutos em gelo.
Lave a suspensão celular com 10 mililitros de meio completo de quatro graus centígrados e remova quaisquer coágulos celulares entre as lavagens para baços de camundongos infectados com plasmódio. Centrifugar as células a 400 G durante cinco minutos a quatro graus centígrados. Em seguida, descarte o sobrenadante.
Agora coloque uma coluna LS ou LD no campo magnético e prepare a coluna enxaguando-a com três mililitros de tampão MACS. Em seguida, aplique a suspensão de célula na coluna. Depois de lavar a coluna três vezes com três mililitros de tampão MACS, colete o fluxo através contendo as células esplênicas.
Colher 10 microlitros das células esplênicas e adicionar 10 microlitros de azul de tripano para verificar a viabilidade celular. Adicione as células ao hemocitômetro. Contar os esplenócitos em uma solução de azul de tripano e verificar a viabilidade celular.
Centrifugar todos os esplenócitos e descartar o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em 40 microlitros de tampão MACS. Adicione 10 microlitros de um coquetel de anticorpos de biotina às células, misture bem e incube por cinco minutos no gelo.
Depois de incubar as microesferas anti-biotina no gelo por 10 minutos, coloque a coluna MACS LS no suporte do campo magnético e prepare a coluna enxaguando-a com três mililitros de tampão MACS. Aplique a suspensão da célula na coluna. Lavar a coluna três vezes com três mililitros de tampão MACS e coletar o fluxo-através contendo todas as células citotóxicas não marcadas.
Após centrifugar o sangue coletado a 350 vezes G por cinco minutos, descartar o soro e ressuspender o sangue em um mililitro de RPMI sem SFB. Após colocar a coluna LS no suporte do campo magnético, enxágue com RPMI e passe a suspensão RBC através da coluna. Uma vez que as células passam através da coluna, centrifugar o fluxo-through, descartar o sobrenadante e reaplicar um mililitro do flow-through na coluna para isolar mais iRBCs.
Lave a coluna duas vezes com cinco mililitros de RPMI. Execute as etapas de lavagem adicionando alíquotas de buffer assim que o reservatório da coluna estiver vazio. Adicione cinco mililitros de RPMI, remova a coluna e limpe os iRBCs em um novo tubo de 15 mililitros.
Diluir um microlitro de uma solução CFSE de 10 milimolares em um mililitro de RPMI sem FBS. Após ressuspender as hemácias em 500 mililitros de RPMI sem FBS, adicionar 500 mililitros do CFSE diluído e incubar por oito minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. Lave as células três vezes com 14 mililitros de meio completo e centrifugue as células duas vezes.
Para co-cultura citotóxica de linfócitos, plaquear as células em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Adicione os linfócitos purificados e as hemácias marcadas com CFSE na relação efetor/célula-alvo desejada para um volume final de 200 mililitros e homogeneize. Prepare cada condição em triplicata e incube as células a 37 graus centígrados.
As iRBCs foram purificadas de camundongos infectados por P.yoelii usando colunas LS. A purificação é destacada por esfregaços de sangue coletados antes e depois do enriquecimento da coluna. A estratégia de gating necessária para avaliar a porcentagem de lise eritrocitária é apresentada aqui.
O portão de parada é colocado na contagem da população de contas. A estratégia de gating é iniciada pela seleção das células únicas, excluindo debris, com base na relação altura/área do pico de dispersão anterior, seguida pela seleção da população de eritrócitos em Ter119+ e CD8-Em seguida, selecione IBCs vivos como CFSE alto positivo. Aqui está a análise aplicada a um exemplo experimental usando diferentes efetores para as razões alvo, exibindo hemácias vivas após a co-cultura.
Uma representação gráfica da porcentagem de lise eritrocitária é mostrada, calculada com base nessa fórmula. A significância entre os grupos que utilizaram CD8 citotóxico ou CD8 virgens de estudo foi avaliada por ANOVA two-way com comparações múltiplas. O método atual explora a lise de hemácias por contato direto de células assassinas, e pode ser planejado para descobrir os mecanismos envolvidos usando anticorpos de bloqueio para receptores ou moléculas específicas.
Este ensaio de morte in vitro apresenta uma nova estratégia para esclarecer os mecanismos da imunidade mediada por células à malária em estágio sanguíneo, o que ajudará no progresso de novas terapias e vacinas contra a malária.
