この作品は、健康DK074656とAI56374（CEM）の国立研究所からの補助金だけでなく、若年性糖尿病研究財団によってサポートされていました。

1。細胞の調製<ol><li>標的細胞培養：マウスのβ細胞株、NIT - 1及びNIT - 4の培養は、10％FBS、0.02％BSA、非必須アミノ酸、15mmのHEPES、16.5を含むDMEMで前に説明した1,2だったGlocoseおよびペニシリン/ストレプトマイシン。 5 × 10 4細胞で平底96穴培養プレートの51 Crのラベル、種子の細胞/ウェル200μlの培養培地中のため。顕微鏡実験、500μlの培養培地中のチャンバーあたり5 × 4で8ウェルのLab -徳IIチャンバーカバーガラスの種子の細胞、および細胞毒性実験に使用する前に48時間のために成長することができます。 </li><li>制御性T細胞株の培養：陰性コントロールとしてJurkat細胞細胞株（ATCC、CD3 +ヒトリンパ球細胞株）を使用してください。 RPMI1640で培養したJurkat細胞は10％FBS、2mMのL -グルタミン、1.5 g / Lの重炭酸ナトリウム、10mMのHEPESおよび1.0mMのピルビン酸ナトリウムを補充した。 </li></ol> 2。エフェクター自己反応性CD8 + T細胞の収集と活性化 NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcraAI4）1Dvs/DvsJは[NOD - AI4a]とNOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcrbAI4）1Dvs/DvsJ [NOD - AI4b]ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から購入し、私たちのマウスの施設で飼育。とNOD - AI4aの交配からのF1雑種子孫NOD - AI4b [NOD - AI4a / b]の年齢の3〜5週間で糖尿病を発症する。すべてのマウスは、特定病原体フリーの施設に収容され、関連する機関の動物実験委員会によって承認された。 <ol><li> CO 2を使用して3から4週齢のNOD - AI4a / Bマウスを安楽死させる。 </li><li>マウスから脾臓を収集する。安楽死させたマウスは、エタノールを噴霧して準備し、手術のフードの下で開かれます。脾臓を除去し、直ちに氷冷したHBSSバッファに置かれます。 </li><li> 7 mLのガラスホモジナイザーを用いて脾細胞を収集する。 2〜3脾臓それぞれは冷たいHBSS 5mLに入れ、7 mLのガラスホモジナイザーでホモジナイズされています。ホモジネートを4℃で5分間、1200rpmで収集し、遠心分離され° CソーバルRT7 +遠心分離機を使用して。細胞ペレットが収集されます。 </li><li>低張液処理を用いて赤血球を削除します。ペレットを、HBSSの等量を加えて中和、5分間氷上で5 mLの低張液/脾臓で処理されています。上記のように、遠心分離によって細胞を回収し、50mlのHBSSに再懸濁します。セルストレイナーを通して浮遊細胞を渡すとTrypanBlue染色と血球計数器を用いてカウント。 </li><li>細胞を活性化させる。 RPMI1640で0.1μMAI4 mimotope（アミノ酸配列のYFIENYLEL）および25 U / mLのIL - 2で3日間培養を用いて5 × 10 6 / mLおよび活性化における再懸濁し、細胞は10％FBSを補充し、2mM L -グルタミン、1.5グラム/ Lの重炭酸ナトリウム、10mMのHEPESおよび1.0mMのピルビン酸ナトリウム。 </li></ol> （3）51 Cr放出アッセイは、CMLを検討する<ol><li>ラベルの標的細胞：3時間1μCi/ウェルと文化で細胞を標的とし、培養液で3回洗浄するための51 Crを追加する。 </li><li>ステップ2.5で述べたように、それぞれに追加された最後のボリュームが十分に200μlになるようにRPMI1640培地にエフェクター細胞を一時停止する。 </li><li>比率：標識した標的細胞の最終洗浄後、ターゲット（T E）にエフェクター希望で、標的細胞の培養に活性化エフェクター細胞を加える。 0.4:1、1:1、2:1、5:1、10:1、20:1と50:1でT比：我々は、通常のEを使用してください。 </li><li>自発的な溶解のコントロールとして動作するように標的細胞の6ウェルに新しい改変RPMI 1640培地を（ステップ2.5参照）を追加します。 </li><li> 16時間共培養エフェクターと標的細胞。 </li><li> 6x50 mm黄ガラスチューブに上清を収集する</li><li> 100μlの2％SDSを添加すると軽く数回ピペッティングして細胞を溶解する。 </li><li> 6x50 mm黄ガラス管の別のセットで細胞ライセートを収集する。 </li><li>クリーンなH 2 Oで一回井戸を洗浄し、細胞溶解液のチューブに洗浄液を加える。 </li><li>ガンマカウンターを用いて上清および細胞溶解物を数える。 </li><li>次のように特異的溶解を計算します。 <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="式（1）" /></li></ol> 4。生細胞イメージングのための細胞の染色最も一般的に使用されるミトコンドリア膜電位の染料の中で、TMRMが少なくともミトコンドリア毒性を示す。従って3、我々はこれらの生細胞イメージング研究のためのTMRMを選択してください。 <ol><li> -20℃でDMSOと店舗では40 mMストックTMRMの溶液を調製[25 nMの] NIT - 1細胞培養1のすべてのサプリメントとフェノールレッドを含まないDMEMで新鮮な実用的なソリューションを行います。 </li><li> 37℃で30分間TMRM 25nMの持つターゲットNIT - 1細胞​​を染色℃に</li><li>染料4の平衡分布を維持するために5nmのTMRMを含む新鮮な培地を使用してメディアを交換してください。 </li><li>血球計数器を用いて活性化エフェクターAI4 T細胞を数える。 </li><li> 1μL/ mLのPicogreen用で活性化したエフェクターAI4 T細胞を染色フェノールレッドを含まない培地で室温と洗浄で5分間3回。 </li></ol> 5。生細胞イメージングを用いて評価するTリンパ球が介在するβ細胞死<ol><li>ツァイスLSM 510共焦点顕微鏡のステージ上で染色されたNITの細胞をチャンバーカバーガラスをマウントします。 etheline酸化物とチャンバーのガラスを殺菌dremmelとガスでタブを削除します。ステージは、37の温度を制御している生細胞イメージングチャンバー℃、5％の水分とCO 2が装備されています。 </li><li>アクティブに追加し、別のEで指定されたチャンバーに染色したT細胞：T比。 </li><li>制御室に染色したJurkat細胞の同じ数を追加しました。 </li></ol> 6。生細胞の画像を取得顕微鏡は、私たちは繰り返し実験の時間の経過とともに自動的に同じまたは別のチャンバーから別の場所で画像を取得するために許可されて電動ステージを装備しています。 <ol><li> 63x油浸対物レンズを使用して、場所ごとに300フレームの合計で3分ごとの間隔で画像を撮影する。 </li><li>発光565〜619 nmの励起波長543 nmの長さとフィルターのセットを使用してTMRM染色を検出</li><li>励起波長488nmおよび発光500〜630 nmのフィルターセットを使用してPicogreen染色を検出する。ビデオは、ツァイスLSMソフトウェアを使用して作成されました。 </li></ol> 7。出版物のためのビデオ変換<ol><li>ツァイスLSMソフトウェアを使用して、AVI形式で圧縮されていないムービーファイルを作成します。 </li><li>公開されたフォーマットにビデオを変換するには、ソフトウェアパッケージフィジー（にビデオをインポート<a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ）、ImageJを（ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info。 nih.gov / IJ /</a>遺伝子座（からBioformatsプラグインを使用して）配布、 <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ）。 </li><li>緑と赤の信号のバランスをとるために明るさとコントラストの設定を調整し、フレームレートは、アニメーションのオプションメニューを使用して、2フレーム/秒に設定されていました。 </li><li>非圧縮のAVIファイルとして512 × 512ピクセル、輸出するビデオをトリミング。 </li><li>ソフトウェアのQuickTime 7（アップルコンピュータ、カリフォルニア州クパチーノ）は、このAVIファイルを開き、1200 KBS /秒で圧縮して、開いているビデオファイル形式H264/MPEG-4でエクスポートする。 </li></ol> 8。代表的な結果： <ol><li> の51 Cr CMLアッセイの代表的な結果。ターゲットの比（X軸）の増加：図1は、パーセント特異的溶解（Y軸）がエフェクターとして増加CMLアッセイの代表的な結果を示しています。標的細胞は、免疫不全NODから分離された主要な島ですRAG1 - / -マウスと51 Crで標識した。上記のステップ2で説明したようにNOD.AI4α/βトランスジェニックマウスから脾細胞を単離し、活性化される。ターゲットとエフェクターを16時間共培養した。上記のステップ3.11に説明するようにパーセント特異的溶解が計算されます。 </li><li> T細胞媒介性のβ細胞のミトコンドリア膜電位損失の二つの代表者（正および負）の結果が表示されます。細胞が染色されたものであり、手順4、5、6で説明したように反応が記録され、ビデオファイルは、手順7のように作成されます。ビデオ1：マウスの​​β細胞株NIT - 1はミトコンドリアの膜電位色素TMRM（赤）を染色した。 50:1のT比：活性化、自己反応性CD8 + T細胞AI4（Picogreenで染色緑）は、これらのNIT - 1 Eで細胞と共培養した。 NIT - 1 400分の持続時間の間、だけAI4 T細胞と相互作用されたクラスタで徐々に消費されるミトコンドリア膜電位。ビデオ2：50:1のT比：対照実験として、NIT - 1細胞​​をTMRMとEでPicogreenステンドJurkat細胞と共培養して染色した。 Jurkat細胞は、一致しないMHCであるヒトT細胞株です。 NIT - 1細胞​​は、400分の共同潜伏期間の全期間を通じてミトコンドリアの膜電位を維持した。 Jurkat細胞は、NIT - 1のクラスターと相互作用しておらず、したがって、殺す誘導しない。 </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="図1" /> NOD.AI4α/βトランスジェニックマウスからのマウスおよび脾細胞- 。標的細胞免疫不全NOD.Rag1 - /から分離された主要な島として使用してCMLの図1代表的な結果。ターゲットとエフェクターを16時間共培養した。エフェクターとしてパーセント特異的溶解が増加：ターゲットの比率が増加する。 ビデオ1。マウスのβ細胞株NIT - 1はミトコンドリアの膜電位色素TMRM（赤）を染色した。 50:1のT比：活性化自己反応性CD8 + T細胞AI4（Picogreenで染色緑）は、これらのNIT - 1 Eで細胞と共培養した。 NIT - 1のミトコンドリア膜電位のdissipa徐々に400分の期間中、しかし唯一の緑AI4 T細胞と相互作用していたクラスタのテッドは。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">ビデオを見るにはここをクリック</a> 。 ビデオ1とPicogreen染色したヒトT細胞株Jurkatと共培養で説明したようにビデオを2。NIT - 1細胞は同じ染色した。 NIT - 1細胞​​は、ミトコンドリア膜電位400分の持続時間を考えを維持することができた。 Jurkat細胞は、NIT - 1のクラスターと相互作用していないため、殺害を誘発しない。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">ビデオを見るためにここをクリック</a> 。

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	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

動物実験は、フロリダ大学の動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

細胞傷害性T細胞を介したβ細胞死は、T1D 5の主な病態である。 51 Cr放出を用いたCMLアッセイは、私たちはエフェクター-ターゲットの反応6の度合いを調べることができます。しかし、詳細なプロセスと、T細胞媒介性のβ細胞死の経路はまだ完全には理解されていない。ミトコンドリアは、β細胞機能と死7の重要なので、我々は、視覚的なCMLの間にミトコンドリ?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> CR - 51 </td><td>パーキンエルマー</td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM） </td><td>インビトロジェン</td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td>インビトロジェン</td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td>アミノ酸配列：YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL - 2 </td><td> R＆D </td><td> 485 - MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25から060 - Clを</td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>双子座</td><td> 400から109 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まないDMEM </td><td>シグマ</td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2インキュベータ</td><td>サーモフィッシャー</td><td> HeraCell 150i </td><td>細胞培養用の滅菌保管</td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>フォーマ1440 </td><td></td></tr><tr><td>使い捨て文化のチューブ、6x50 mm黄ガラス</td><td>フィッシャー</td><td> 14から958 - </td><td></td></tr><tr><td>ガンマカウンタ</td><td>パーキンエルマー</td><td>ウィザード1470自動ガンマカウンター</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> LSM 510共焦点メタ</td><td>電動ステージと生細胞のチャンバーで</td></tr><tr><td>ピペット（1ミリリットル、200μlの、20μlの、10μlの、2μlの） </td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ（アンバー） </td><td>フィッシャー</td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td>ソーバルレジェンドRT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcraAI4）1Dvs/DvsJマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcrbAI4）1Dvs/DvsJマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD -AI4α/βF1マウス</td><td> N / </td><td> N / </td><td>フロリダ大学の動物施設で飼育</td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

1型糖尿病（T1D）は、T細胞媒介性自己免疫疾患である。インスリン産生が失われると病因の間に、患者は、T細胞による膵β細胞の破壊から、おそらくこの結果は、次第にinsulinopenicになる。 T1Dの開発中にベータ細胞死のメカニズムを理解することはこの病気のための効果的な治療法を生成するための洞察を提供します。細胞媒介lymphocytotoxicity（CML）アッセイは、歴史的に標的細胞を標識する放射性核種クロム51（51 Cr）を使用している。これらのターゲットは、エフェクター細胞に曝露されており、標的細胞からの51 Crの放出は、リンパ球が介在する細胞死の指標として読み込まれます。 51 Crの減少のリリースでは細胞死の結果の阻害剤。 エフェクター細胞として、我々はAI4 T細胞受容体（TCR）のαとβ鎖の両方のためのマウスの株式のトランスジェニックから分離されたCD8 +細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の活性化自己反応性クローン集団を使用する。活性化さAI4 T細胞が16時間の51 Cr標識標的NITの細胞と共培養された、51 Crの放出は、特異的溶解を計算するために記録されたミトコンドリアなどのエネルギー生産、伝達をシグナル伝達の調節、およびアポトーシスなどの多くの重要な生理学的なイベントに参加。 T1Dの開発中のベータ細胞のミトコンドリアの機能変化の研究は、研究の新たな領域です。ミトコンドリア膜電位色素テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）と共焦点顕微鏡、ライブセルイメージングを使用して、我々は、β細胞株NIT - 1で時間をかけてミトコンドリア膜電位をモニターする。イメージング研究のために、エフェクターAI4 T細胞は、蛍光核染色色素Picogreenで標識した。 NIT - 1細胞とT細胞はチャンバーカバーガラスで共培養し、生細胞のチャンバーを装備した顕微鏡ステージに搭載された、37℃に制御された° C、5％CO 2、及び加湿付き。これらの実験中にイメージは、各クラスタから400分毎に3分を採取した。 400分のコースで、我々はAI4 T細胞が接続されていたNIT - 1細胞​​クラスターのミトコンドリア膜電位の散逸を観察した。 NIT - 1細胞​​はMHCの不整合ヒトリンパ球Jurkat細胞と共培養した同時対照実験では、ミトコンドリアの膜電位はそのまま残った。この手法は、細胞傷害性リンパ球、サイトカイン、または他の細胞毒性試薬の攻撃を受けて細胞内のミトコンドリア膜電位のリアルタイムの変化を観察するために使用することができます。

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

細胞媒介のlymphocytotoxicity（CML）アッセイは、in vitroにおける自己反応性応答と細胞死の研究のメカニズムをテストするために使用することができます。しかし、蛍光染料、型と細胞死だけでなく、利用経路の動態と生きた細胞の共焦点顕微鏡イメージング技術を用いてより詳細に調べることができる。

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.3K ビュー.  University of Florida. 細胞媒介のlymphocytotoxicity（CML）アッセイは、in vitroにおける自己反応性応答と細胞死の研究のメカニズムをテストするために使用することができます。しかし、蛍光染料、型と細胞死だけでなく、利用経路の動態と生きた細胞の共焦点顕微鏡イメージング技術を用いてより詳細に調べることができる。

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Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

免疫・感染学

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on extracellular matrix proteins, for measuring the motility of fluorescently-labeled, non-adherent human or murine effector immune cells. This technique employs a stainless steel manifold and 10-well Teflon slide to focally deposit non-adherent T cells into wells prepared with either confluent tumor cell monolayers or extracellular matrix proteins. Light and/or multi-channel fluorescence microscopy is used to track the movement and behavior of the effector cells over time. Fluorescent dyes and/or viral vectors that code for fluorescent transgenes are used to differentially label the cell types for imaging. This method is distinct from similar-type in vitro assays that track horizontal or vertical migration/invasion utilizing slide chambers, agar or transwell plates. The assay allows detailed imaging data to be collected with different cell types distinguished by specific fluorescent markers; even specific subpopulations of cells (i.e., transduced/nontransduced) can be monitored. Surface intensity fluorescence plots are generated using specific fluorescence channels that correspond to the migrating cell type. This allows for better visualization of the non-adherent immune cell mobility at specific times. It is possible to gather evidence of other effector cell functions, such as cytotoxicity or transfer of viral vectors from effector to target cells, as well. Thus, the method allows researchers to microscopically document cell-to-cell interactions of differentially-labeled, non-adherent with adherent cells of various types. Such information may be especially relevant in the assessment of biologically-manipulated or activated immune cell types, where visual proof of functionality is desired with tumor target cells before their use for cancer therapy.

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

ラジアルモビリティおよびレトロウイルス複製ベクター形質導入、非付着Alloresponsive Tリンパ球の細胞傷害機能

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

ヒトパラティーノ扁桃腺からBおよびTリンパ球の効率的な単離プロトコール

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

免疫調節薬を同定するためのTリンパ球におけるマイトジェン誘導性の幼若の迅速定量

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...