マイクロマシン加工された接着ビニール層と真皮コンパートメント生成のための平行流方法論を使用して3Dスキンオンチップをモデリングするための新しいリソグラフィーフリープロトコルです。マイクロマシンドビニールは、PDMSおよび従来のリソグラフィアプローチの制限の一部を克服し、デバイスのレイアウトにおける製造プロセスと汎用性においてよりシンプルさを提供します。この多層スキンオンチップは、低コストでハイスループットスクリーニングを可能にし、いくつかの疾患をモデル化するために使用できるため、薬物および化粧品の検査アプローチに使用できます。
ブラザーキャンバスワークスペースソフトウェアを使用してマイクロ流体チップを設計することで始めます。30×30センチメートルのワークスペースを作成し、それをsvgファイルに保存する前に、チップの異なる層の設計パターンで埋めます。30センチメートルのビニールシートを切ります。
低タックの粘着マットに貼り付け、必要に応じてすべての気泡を除去します。USB ドライブを使用して、svg ファイルをエッジ プロッタにアップロードし、切断パラメータをレベル 0 のカット圧力、レベル 3 の切断ブレード、切断速度のレベル 1 として設定します。パラメータを設定したら、ビニールを持つ粘着マットをプロッタに配置し、95マイクロメートルの厚さのビニールでチャネルパターンを切断するプロセスを開始します。
適切な調整チャネル、入口、およびコンセント用のアライナを使用してデバイス全体を組み立てます。下部のチャネルを組み立てるための対応するマイクロマシンの設計でビニール層のために積み重ね、アライナに付着しないように底層のカバーテープを保持します。入口を覆うことなく、ポリカーボネート多孔膜を下チャンネルの上にカットして配置します。
上部室のデザインで10個のビニール層を追加し、上に両面テープの最終層を貼り付けます。チップをアライナーから取り外し、ガラススライドに貼り付けます。厚さ2ミリメートルのPDMSシートを両面テープビニール層の上に置きます。
チップが完全に水密であることを確認するには、チップの上に一晩重量を残します。翌日、チップを70%エタノールで5分間洗い流し、続いて蒸留水で洗浄して殺菌します。ポンプ1とポンプ2を上部室入口1と上部室入口2にそれぞれ接続します。
ポンプ3を下室入口に接続し、上部チャンバーと下部室の出口を廃槽に接続します。PTFEチューブと18ゲージのステンレス鋼コネクタを使用して、各インレットに注射器を接続します。ポンプ3でポンプ3分毎分50マイクロリットルで下室入口を通して、そして毎分100マイクロリットルで上の部屋の入口2を通してポンプ2を備える。
次に、フィブリノーゲンプレゲルをシリンジに積み込み、すぐにポンプ1に入れ、毎分200マイクロリットルで動かします。プレゲルが上層室出口から出たら、ポンプ1と2を止め、チューブを取り外さずにチップを残して37°Cで10分間ゲル化を可能にする。ゲレーション後、上部チャンバーの入口1をキャップでブロックし、一晩50マイクロリットルでポンプ3で上チャンバー入口2を通して培養培地をポンプで送る。
真皮コンパートメントの生成から24時間後、ヒト原発性線維芽細胞がアセンブリ内に広がっていることを確認し、1分間40マイクロリットルで上チャネル入口2を通して1ミリリットル当たり10倍から6 HKCsを導入する。細胞の取り付けについては、湿度飽和インキュベーターに37°Cでチップを一晩置きます。1分間に50マイクロリットルで下室の入口を通してポンプ3で新鮮な培養培地をポンピングし始める。
代表的な分析では、アセンブリの上部チャンバーに沿ったヒドロゲルの高さが表示される。平均高さ550マイクロメートルは、犠牲PBSとプレゲルの1分あたりの流量100と200マイクロリットルでゲルの機能に最適でした。下層チャネルを通してPBSをフラッシュできなかった場合、ゲルの理論高さと測定されたものとの間の不一致が生じ、並列流プロトコルの開始から24時間後に40%の差を付け、ヒトの原発線維芽細胞がアセンブリの上部チャンバーのフィブリンゲルに正常に広がることを発見し、 その後、緑色蛍光タンパク質発現性HKCをヒドロゲルの上に効果的に播種することができる。
HKCSが沈着するようにシステムを一晩閉じ込めずにチューブを除去すると、細胞の不均一でコンフルエントな単層が生じた。マイクロ流体チップにおける未分化皮膚モデルの3D共焦点解析は、下部に埋め込まれた線維芽細胞から上方のHKCsを分離するヒドロゲルの表面を明確に示した。生成された皮膚は、成熟した区別された表皮を得るために空気/液体界面に露出することができ、さらにいくつかの真皮および表皮マーカーを使用して特徴付けることができる。
この技術は、より速く、より安価なデバイスの製造、およびマイクロ流体を使用して多層皮膚の生成を可能にし、薬物および化粧品のテストのためのより現実的なアプローチを提供する。
