トンネリングナノチューブ固有のマーカーの欠如は、この分野の進歩を制限し、トンネリングナノチューブを識別、特性評価、および定量化する方法に対する需要が高まっています。自動検出方法は、アルゴリズムの開発や既存のアルゴリズムの変更の専門知識がなければ実装が困難ですが、手動の方法はより正確に簡単に実装できます。トンネルナノチューブを介した長距離細胞間移動は、神経変性病理、ウイルス拡散、癌など、さまざまな疾患モデルでいくつかの方法で実装されています。
したがって、病因におけるナノチューブの役割を理解するためのトンネルナノチューブの研究は重要です。染色プロセス中にトンネルナノチューブが破損する可能性があります。カバースリップを使用したり、スライドに取り付けたりすることは避け、代わりにガラス底のイメージングディッシュを使用してください。
修正された固定プロトコルは、トンネリングナノチューブを無傷に保つのに役立ちます。手順を実演するのは、サンギータNAFの研究室の博士課程の学生であるディーパックKVです。まず、コントロールおよびオリゴマーA-β処理細胞をPBSで2分間2回洗浄してから固定します。
pH 7.2の0.1モルリン酸緩衝液に溶解した2%ホルマリン固定液と2.5%グルタルアルデヒドを使用して、カルノフスキーの固定液を調製します。次に、カルノフスキーの固定液を室温で45分間加えて、イメージングディッシュ内の細胞を固定します。0.1グラムのサポニンを5ミリリットルのFBSに溶解し、95ミリリットルのPBSを加えて希釈してインキュベーションバッファーを調製します。
その後、固定した細胞をインキュベーションバッファーを用いて2分間2回洗浄する。固定後、ホスホ-PAK1に対する最初の抗体を加え、インキュベーションバッファーに1〜250の希釈を加え、暗くて湿ったチャンバーで摂氏4度で一晩インキュベートします。24時間のインキュベーションの翌日、細胞をインキュベーションバッファーで2分間2回洗浄する。
次に、Alexa Fluor 488およびファロイジン555に結合した二次抗体を追加します。細胞を暗くて湿ったチャンバー内で室温で1.5時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をインキュベーションバッファーで2分間2回洗浄する。
DAPIを1〜2000倍に希釈して核を染色し、暗所で室温で5〜10分間インキュベートします。90%グリセロールと10%PBS中の25ミリグラムのDABCOを使用してDABCO封入剤を準備します。適切に溶解するには、分光光度グレードの希塩酸を使用してpHを8.6に調整し、溶液をロッカーに置いて混合します。
漂白防止剤として、DABCO封入剤を、底部にカバースリップを含むイメージングディッシュに直接追加します。少なくとも1〜2時間待ってから、共焦点イメージングの実行に直接進みます。トンネルナノチューブを特定するには、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して免疫染色細胞のZスタック画像をキャプチャし、最初にチャネルを選択し、共焦点ソフトウェアのウィンドウトラック1、トラック2、トラック3で必要なレーザーを順番にクリックします。
トラック1ウィンドウの下にあるオプションTPMTをクリックして、蛍光チャンネルを含む微分干渉コントラスト画像を撮影します。ソフトウェアの[取得]タブを選択し、[Zスタック]タブをクリックして、ウィンドウが開くのを待ちます。次に、をクリックします ライブスキャン 皿の下部にあるセルに焦点を合わせます。
フォーカスされた画像を最初のスタックとして選択し、上に焦点を合わせてセルの一番上の部分を表示し、それを最後のスタックとして選択します。ライブスキャンを停止し、[最適]タブの横にある数字をクリックして、セルの厚さに基づいてスライスの数と間隔を決定するスタックのステップサイズを修正します。405ナノメートル、488ナノメートル、および561ナノメートルのレーザーでDAPI、FITC、およびTRITCの3つのチャネルの連続画像を撮影し、1.02マイクロ秒のピクセル滞留時間でキャプチャします。
蛍光チャンネルでDICチャンネルで画像を撮影し、細胞境界を観察します。フィジーのソフトウェアでcziデータ形式で保存された共焦点画像を開いて分析します。Hyperstackオプションを選択して、イメージの各Zスタックとチャンネルを表示します。
チャネルと Z スタックのスクロール バーをスクロールして、目的の特定のチャネルの正確なスタックを選択します。次に、最初にチャンネルバーをスクロールしてF-アクチン染色チャンネルを選択し、Zスタックを手動でスクロールして各スタックを1つずつ表示します。Zスタックの下部に見え、Zが神経突起として2に等しいイメージングディッシュの表面に近い細胞を接続しているように見えるFアクチン染色構造を特定します。
トンネルナノチューブ、F-アクチン正ホバリングセルをZから4に等しい上に向かってスクロールすることによって細胞導管に正のホバリングを同定する。Zスタックの下部近くで表面に向かって神経突起を探し、Zスタックが6に等しいZスタックの上部に向かってスクロールすると、神経突起が消え始めることを確認します。Zスタックからの導管のホバリング特性を分析することにより、F-アクチン陽性トンネルナノチューブと同様にホスホ-PAK1正トンネリングナノチューブを特定します。
ホスホPAK1染色はF-アクチン染色よりも弱いため、Zが4に、Zが6に、ホスホPAK1染色されたトンネルナノチューブを探します。さらに、DIC画像を観察し、F-アクチンおよびホスホ-PAK1染色されたトンネルナノチューブ構造体が細胞間の膜導管であることを確認した。さらに、F-アクチンチャネルとホスホ-PAK1チャネルをマージして、同定されたトンネルナノチューブがF-アクチンとホスホ-PAK1の共染色構造であることを確認します。
トンネリングナノチューブを定量化するには、総細胞数と同定されたトンネリングナノチューブを手動でカウントし、その数をパーセンテージで表します。ホバリング導管のようなFアクチンとベータIIIチューブリンの正のトンネリングナノチューブをZスタック画像から区別するには、FアクチンとベータIIIチューブリンチャネルをマージし、マージされた画像のZスタックを分析します。3に等しいZでかすかに見え、6に等しいZと9に等しいZで目立つF-アクチン染色トンネルナノチューブのみを探してください。
同様に、F-アクチンとベータIIIチューブリンを特定します。Zが6に等しく、Zが9に等しいホバリング導管のような二重正のトンネリングナノチューブ。Zスタックの下部から他のFアクチンおよびベータIIIチューブリン染色された非ホバリング突起を特定します。
フィジーのラインツールを使用して、トンネルナノチューブの直径を測定します。[分析]をクリックして測定のスケールを確認し、ピクセル単位の距離がczi画像から自動的に設定されるようにスケールを設定します。XY平面におけるトンネルナノチューブの直径を測定します。
3D再スライスとしきい値対応の3D視覚化を可能にするフィジーのボリュームビューアプラグインを使用して、Zスタック画像を個々のチャネルに分割します。次に、単一チャンネルのZスタック画像をトリミングして、3D再構成ビューを使用して、一度に1つまたは2つのトンネルナノチューブまたは神経突起を強調表示します。単一のトンネルナノチューブまたはニューライトをXY平面に固定し、XZおよびYZアクセス断面をマークします。
XZ平面の下部、XZおよびYZ平面の神経突起、および上部のZスタックのトンネルナノチューブを観察します。個々のトンネリングナノチューブまたはニューライトを選択して、XZ平面の3Dボリュームビューを再構築します。3D再構成では、Z面の下部にある神経突起と、底部のZ平面に触れることなく2つの細胞を接続するホバリング構造として現れるトンネルナノチューブを観察します。
F-アクチンおよびホスホ-PAK1で免疫染色した細胞の共焦点Zスタック画像を解析し、トンネルナノチューブを同定した。さらに、DIC画像を解析し、F-アクチンおよびホスホ-PAK1染色されたトンネルナノチューブ構造が細胞間の膜導管であることを確認しました。細胞をF-アクチンおよびβIIIチューブリンで二重免疫染色し、トンネルナノチューブ様F-アクチンおよびトンネリングナノチューブ様F-アクチンおよびβIIIチューブリン二重陽性膜導管は、F-アクチン陽性トンネルナノチューブのみと区別された。
ホスホPAK1とF-アクチンを共発現させたトンネルナノチューブは、基層に触れることなく2つの細胞間をホバリングするという特性に基づいて3Dボリュームビュー画像を構築することにより、他の神経突起の細胞突起と区別されました。サンプルの不完全な固定は、標的タンパク質の急速なタンパク質分解および特異的免疫反応性の低下につながる可能性があるため、右固定剤の使用は重要である。
