このビデオで説明されているのは、活性化T細胞の形質導入を効率的に促進するDryduxとして知られる乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドを作成して使用するためのプロトコルです。Dryduxは、ウイルスを播種したレトロネクチンコーティングプレートのゴールドスタンダードのスピンノキュレーションの代わりに使用するように設計されており、細胞の形質導入プロセスを簡素化します。Dryduxは、レトロネクチンコーティングプレート上のスピノキュレーションに匹敵する形質導入効率を有し、従来の形質導入法に代わる安価で便利な方法として機能します。
まず、0.4%カルシウム-D-グルコン酸塩の溶液を調製します。滅菌ろ過したDI水をビーカーのカルシウム-D-グルコン酸塩に加えます。カルシウム-D-グルコン酸塩が溶解するまで中速で攪拌しますが、これには約1時間半かかります。
溶解したら、カルシウム-D-グルコン酸溶液を滅菌濾過する。この溶液は室温で保存することができる。次に、2%アルギン酸塩溶液を調製します。
これは、スクリューキャップバイアルまたはビーカーを使用して達成することができる。両方がここに表示されます。超高純度アルギン酸塩を容器に慎重に加えます。
アルギン酸塩に適量のDI水を加えます。混合を妨げない可能な限り最大の攪拌子を選択し、それを容器に追加します。アルギン酸塩が溶解するまで溶液を強火で攪拌しますが、これには約1時間かかります。
容器の側面に大きなアルギン酸塩の塊がある場合は、血管を横に傾けて取り除きます。小さな塊は1時間かけて溶解し、心配する必要はありません。2%アルギン酸溶液が溶解したら、攪拌速度を下げます。
等量のカルシウム-D-グルコン酸塩溶液をアルギン酸塩溶液にゆっくりと加えます。ゆっくりと追加すると、架橋塊の形成を防ぐのに役立ちます。グルコン酸カルシウム溶液を加えたら、攪拌速度を上げ、15分間激しく攪拌します。
容器を横に傾けて、形成された可能性のある塊を取り除きます。15分間激しく攪拌した後、溶液に塊がないことを確認します。溶液を48ウェルまたは24ウェルプレートにピペットで入れます。
48ウェルプレートの場合、各ウェルに300マイクロリットルをピペットで入れます。溶液は粘性があり、先端にくっつく可能性があるため、ゆっくりとキャストし、チップを頻繁に交換してください。24ウェルプレートの場合は、各ウェルに1ミリリットルずつピペットで入れます。
繰り返しますが、ゆっくりとキャストし、ピペットチップを頻繁に交換します。ウェルプレートを蓋で覆い、マイナス20°Cで一晩凍結する。蓋を外し、ワイプと輪ゴムで上部を固定して、凍結乾燥機用のプレートを準備します。
プレートを凍結乾燥機チューブに入れ、凍結乾燥機に72時間置きます。72時間後、凍結乾燥機からプレートを取り外します。これで、足場を形質導入に使用する準備が整いました。
足場をすぐに使用しない場合は、プレートをパラフィルムで密封し、必要になるまで摂氏4度で保管してください。長期保存の場合は、パラフィルムによるシールに加えて、プレートを真空シールすることをお勧めします。2ミリリットルのウイルス溶液を遠心フィルターを通して1, 500 gで10分間遠心分離することにより、ウイルス上清を濃縮します。
足場あたり100〜200マイクロリットルの濃縮ウイルスが必要です。濃縮ウイルス溶液の量が200マイクロリットルを超える場合は、さらに数分間回転します。各足場について、50マイクロリットルの完全な細胞培養培地に懸濁した100万個の活性化T細胞のアリコートを作ります。
濃縮ウイルスを細胞懸濁液に加える。細胞ウイルス懸濁液の総容量は、48ウェル足場の場合は200マイクロリットル、24ウェル足場の場合は350マイクロリットルを超えてはなりません。細胞ウイルス混合物を乾いた足場の上部に滴下して加えます。
ネガティブコントロール実験では、濃縮ウイルスの代わりに完全な細胞培養培地を使用してください。この細胞懸濁液を乾いた足場の上部に加える。細胞培養インキュベーター内の足場を摂氏37度で45〜60分間インキュベートします。
インキュベーターから足場を取り外します。足場はこの間に溶液を完全に吸収するはずです。増殖を誘導するには、IL-7およびIL-15を添加した完全な細胞培養培地を各ウェルに追加します。
IL-2も使用することができる。24ウェル足場の場合は、1ミリリットルを追加します。48ウェル足場の場合は、500マイクロリットルを追加します。
摂氏37度で72時間インキュベートします。細胞は72時間にわたって増殖し、培地がオレンジ色に変わる可能性があります。各ウェルから余分な培地を取り除きます。
足場から細胞を単離するには、各足場に0.25モルのEDTA溶液を追加します。24 ウェル足場の場合は 1 ミリリットル、48 ウェル足場の場合は 300 マイクロリットルを追加します。プレートをそのままにするか、3〜4分間静かに攪拌します。
ほとんど溶解したら、ウェル内でピペットで静かに出し入れします。足場を完全に溶解するには、いくつかのピペッティング手順が必要になる場合があります。溶液を15ミリリットルの遠沈管に移します。
細胞をPBSで2回洗浄します。各遠沈管に12ミリリットルのPBSを追加します。400gで5分間遠心分離する。
チューブの底にセルペレットが形成されます。上澄み液を吸引し、洗浄を繰り返す。すべてのEDTAを取り除くことが重要であるため、洗浄するたびに上清を完全に除去するように注意してください。
PBSで2回洗浄した後、細胞ペレットは分析の準備が整います。フローサイトメトリーを使用して、各群の形質導入効率を決定しました。非形質導入細胞を陰性対照として用い、形質導入を示さなかった。
GFPレトロウイルスを含まない足場に播種した細胞も形質導入を示さなかった。乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールド上に細胞を播種したDryduxグループは、85%の形質導入を示し、RetroNectinグループよりもわずかに低かった。これらの結果は、Dryduxスキャフォールドがレトロネクチンコーティングプレートの脊髄分泌を必要とせずに、レトロウイルス遺伝子導入によって効果的に形質導入された細胞を実証する。
Dryduxスキャフォールドは、レトロネクチンに匹敵する高い形質導入効率を示し、T細胞を形質導入するための代替方法を提供します。Drydux足場の製造コストが低いため、このプロセスはCAR T細胞療法のコストを大幅に削減する可能性があります。
