このプロトコルは、モデル生物C.elegansにおける縦断的分析と転写分析を組み合わせた2つの脂質補給戦略について説明しています。この手法では、少数のワームまたは解剖されたワーム組織を使用して転写変化を調べる方法と、バグ集団の液体供給をハイドロ技術と組み合わせる方法について説明します。この技術を実行する個人は、適切な転写分析を達成するために実験を実行するための短い時間枠のために組織解剖を練習しなければならない。
はじめに、一晩増殖させた培養物を室温で10分間4, 000 Gで遠心分離することによってOP50細菌を集める。上澄み液を捨てる。ボルテックスにより細菌ペレットを20ミリリットルの細菌希釈、食事制限またはBDRベースに懸濁し、再度、遠心分離を10分間繰り返す。
上清を廃棄した後、細菌ペレットをBDR培地に再懸濁し、20X BDR細菌ストックを調製した。使用前にBDR培地を使用して細菌ストックを5倍に希釈してください。エタノールまたはジメチルスルホキシドを溶媒として使用し、新しいオートクレーブ滅菌ガラスバイアルに脂質ストック溶液を調製し、酸化を防ぐためにガラスバイアルにアルゴンまたは窒素を充填します。
脂質ストック溶液をBDR細菌溶液に移して、給餌条件で所望の最終濃度を達成する。20秒間ボルテックスして完全に混ぜます。同量の濾過エタノールまたはジメチルスルホキシドをBDR細菌と混合することによって制御されたビヒクルを準備する。
所望の量の脂質またはビヒクルコントロールを、各給餌条件に対して3〜4回の反復で12ウェルプレートの各ウェルに移すことによって、脂質補給および液体培養を行う。同期したCaenorrhabditis elegansワーム懸濁液を5倍のBDR細菌と1対1の比率で混合して、1ミリリットルあたり1, 500虫、細菌の最終濃度2.5倍を達成します。次に、2ミリリットルのワーム細菌混合物を12ウェルプレートの各ウェルに移します。
完了したら、12ウェルプレートをホイルで包み、摂氏20度のインキュベーター内でプレートを100 RPMMで希望のインキュベーション長に振とうします。プレートへの脂質補給のために、1ミリリットルの脂質コンディショニング細菌を10センチメートルの線虫増殖培地またはNGM寒天プレートの中心に播種します。多数のプレートで作業する場合は、2つのプレートをシードする間に最終的な作業溶液が複数回ボルテックスされていることを確認してください。
バイオセーフティフード内の暗闇でプレートを乾燥させます。同期ワーム培養物から3000匹のワームを10センチメートルのプレートに移します。脂質補給プレートの上を泳いでいたワームが這い始めるまで、バイオセーフティフードでプレートを乾燥させます。
乾燥したら、脂質調整プレートを摂氏20度のインキュベーター内で所望の時間インキュベートし、多価不飽和脂質を使用する場合はプレートを光から保護します。PCRチューブで0.2マイクロリットルのDNase Iと19.8マイクロリットルの溶解溶液を混合して、各サンプルに20マイクロリットルの最終溶解溶液を調製し、5回上下にピペッティングしてよく混合します。少数の全ワームからRNAを抽出するには、15〜20匹のワームをバクテリアの芝生から播種したばかりのNGMプレートに移して細菌を除去します。
播種されていないNGMプレートから、最小数の細菌で新たに調製した最終溶解溶液20マイクロリットルを含むPCRチューブに15〜20匹のワームを移し、室温で5分間溶解反応をインキュベートします。インキュベーションが終了したら、サンプルを素敵な冷水浴に保ち、ワームを4回超音波処理し、超音波処理の各時間の間に30%振幅とパルスで毎回5秒間超音波処理します。チューブを室温で5分間インキュベートしてから、2マイクロリットルの停止液を溶解反応に加え、軽くたたくことで混合します。
反応物を室温で2分間インキュベートし、次いでチューブを氷上に置く。ワーム組織からRNAを抽出するには、細菌の芝生から約20匹のワームを選び、それらを新しい播種されていないNGMプレートに入れて、ワームから細菌を除去します。できるだけ少ない細菌を含む20匹のワームを、4マイクロモルのレバミゾールを含む500マイクロリットルのM9溶液を含む時計のグラスに移します。
ワームが固定されたら、1ミリリットルの注射器に取り付けることができる25ゲージの針を使用して生殖系列または腸を解剖します。オートクレーブ処理されたガラスピペットを使用して、解剖した組織をPCRチューブに移し、チューブを氷上に2分間沈降させて、底部に材料を堆積させます。PCRチューブから上清を取り除き、20マイクロリットルの最終溶解溶液を加え、軽くたたいてよく混ぜます。
溶解反応を5分間インキュベートした後、2マイクロリットルの停止液を加え、チューブを複数回タップします。逆転写に進む前に、チューブを2分間インキュベートします。検証研究では、大規模な集団と少数のワームから抽出されたRNAは、神経ペプチドプロセシング遺伝子egl-3およびegl-21の同様の誘導を示しました。
これは、少数のワームからのRNA抽出が、大規模な集団からの標準的なCDNA合成技術の有効な代替手段になり得ることを示唆している。ジホモ - γ-リノレン酸(DGLA)を補充したlipl-4導入遺伝子線虫の解剖された腸では、ニューロン神経ペプチドプロセシング遺伝子は誘導されなかった。異なる濃度でのDGLA補給は、脂肪3ノックダウン時の線虫の寿命延長を救った。
脂質補給を施したワームは、RNAシーケンシング、プロテオミクス、メタボロミクス、および行動研究のために処理して、これらの特定の条件下で追加の表現型を特定することもできます。この方法論は、老化研究、脂質生物学、および特定の表現型と栄養因子または代謝物との関係を確立することを目的としたその他の研究分野に適用できます。
