يصف هذا البروتوكول استراتيجيتين لمكملات الدهون مع مزيج من التحليل الطولي والنسخ في الكائن الحي النموذجي ، C.elegans. تصف هذه التقنية كيفية فحص التغيرات النسخية باستخدام عدد قليل من الديدان أو أنسجة الديدان المشرحة وكيف يمكن أن تقترن التغذية السائلة لمجموعة الحشرات بالتقنيات المائية. يجب على الأفراد الذين يقومون بهذه التقنية ممارسة تشريح الأنسجة بسبب النافذة الزمنية القصيرة لإجراء التجربة لتحقيق تحليل النسخ المناسب.
للبدء ، اجمع بكتيريا OP50 عن طريق الطرد المركزي للثقافة المزروعة طوال الليل عند 4،000 G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية. تعليق الحبيبات البكتيرية في 20 ملليلتر من التخفيف البكتيري أو التقييد الغذائي أو قاعدة BDR عن طريق الدوامة ومرة أخرى ، كرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في وسط BDR لتحضير مخزون بكتيري 20 X BDR. قم بتخفيف المخزون البكتيري إلى 5X باستخدام وسيط BDR قبل الاستخدام. باستخدام الإيثانول أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد كمذيب ، قم بإعداد محلول مخزون الدهون في قارورة زجاجية معقمة جديدة واملأ القارورة الزجاجية بالأرجون أو النيتروجين لمنع الأكسدة.
انقل محلول مخزون الدهون إلى محلول بكتيريا BDR لتحقيق التركيز النهائي المطلوب في ظروف التغذية. امزجه جيدا عن طريق الدوامة لمدة 20 ثانية. قم بإعداد السيارة التي يتم التحكم فيها عن طريق خلط نفس الأحجام من الإيثانول المصفى أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد مع بكتيريا BDR.
قم بإجراء مكملات الدهون وزراعة السوائل عن طريق نقل الكمية المطلوبة من الدهون أو التحكم في السيارة إلى كل بئر من لوحة 12 بئر مع ثلاثة إلى أربعة مكررات لكل حالة تغذية. امزج معلق دودة Caenorrhabditis elegans المتزامن مع بكتيريا BDR 5X بنسبة واحد إلى واحد لتحقيق تركيز نهائي قدره 1،500 دودة لكل ملليلتر و 2.5X للبكتيريا. ثم انقل مليلتر من خليط بكتيريا الدودة إلى كل بئر من صفيحة البئر 12.
عند الانتهاء ، لف لوحة البئر 12 بورق القصدير وهز اللوحة في حاضنة 20 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لطول الحضانة المطلوب. لمكملات الدهون على الأطباق ، قم بزرع ملليلتر واحد من البكتيريا المكيفة الدهنية في مركز وسط نمو الديدان الخيطية 10 سم أو صفيحة أجار NGM. تأكد من أن حل العمل النهائي يتم دوامة عدة مرات بين بذر الصفيحتين عند العمل مع عدد كبير من الألواح.
جفف الطبق في الظلام داخل غطاء السلامة البيولوجية. نقل 3000 دودة من ثقافة الدودة المتزامنة إلى لوحة 10 سم. جفف الصفيحة في غطاء السلامة البيولوجية حتى تبدأ الديدان التي كانت تسبح على الألواح المكملة للدهون في الزحف.
بمجرد التجفيف ، قم باحتضان الصفيحة المكيفة بالدهون في حاضنة 20 درجة مئوية للمدة الزمنية المطلوبة ، وفي حالة استخدام الدهون المتعددة غير المشبعة ، قم بحماية اللوحة من الضوء. تحضير 20 ميكرولترا من محلول التحلل النهائي لكل عينة عن طريق خلط 0.2 ميكرولتر من DNase I مع 19.8 ميكرولتر من محلول التحلل في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل وخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل خمس مرات. لاستخراج الحمض النووي الريبي من العدد الصغير من الديدان الكاملة ، قم بإزالة البكتيريا عن طريق نقل 15 إلى 20 دودة من العشب البكتيري إلى صفيحة NGM غير المصنفة حديثا.
انقل 15 إلى 20 دودة من صفيحة NGM غير المصنفة إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على 20 ميكرولتر من محلول التحلل النهائي الطازج مع الحد الأدنى لعدد البكتيريا واحتضان تفاعل التحلل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد انتهاء الحضانة ، احتفظ بالعينة في حمام ماء بارد لطيف ودقق في الديدان أربع مرات ، خمس ثوان في كل مرة بسعة 30٪ ونبض لمدة 15 ثانية بين كل مرة من الصوتنة. احتضن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل إضافة ميكرولتر من محلول التوقف في تفاعل التحلل واخلطه عن طريق النقر اللطيف.
احتضان التفاعل لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ثم اضبط الأنبوب على الجليد. لاستخراج الحمض النووي الريبي من أنسجة الدودة ، اختر حوالي 20 دودة من العشب البكتيري وضعها في صفيحة NGM جديدة غير مصنفة لإزالة البكتيريا من الديدان. انقل 20 دودة بأقل عدد ممكن من البكتيريا إلى زجاج ساعة يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول M9 يحتوي على أربعة ليفاميزول ميكرومولاري.
عندما يتم تجميد الديدان ، قم بتشريح الخط الجرثومي أو الأمعاء باستخدام إبرة قياس 25 يمكن توصيلها بحقنة ملليلتر واحد. باستخدام ماصة زجاجية معقمة ، انقل الأنسجة المشرحة إلى أنبوب PCR وقم بتثبيت الأنبوب على الجليد لمدة دقيقتين مما يسمح بترسب المادة في الأسفل. قم بإزالة المادة الطافية من أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل إضافة 20 ميكرولتر من محلول التحلل النهائي واخلطها جيدا عن طريق النقر.
بعد احتضان تفاعل التحلل لمدة خمس دقائق ، أضف ميكرولتر من محلول التوقف واضغط على الأنبوب عدة مرات. احتضان الأنبوب لمدة دقيقتين قبل المتابعة إلى النسخ العكسي. في دراسة التحقق من الصحة ، أظهر الحمض النووي الريبي المستخرج من عدد كبير من السكان وعدد قليل من الديدان تحريضا مشابها لجينات معالجة الببتيد العصبي ، egl-3 و egl-21.
ويشير إلى أن استخراج الحمض النووي الريبي من عدد قليل من الديدان يمكن أن يكون بديلا صالحا لتقنيات تخليق CDNA القياسية من مجموعات سكانية كبيرة. في الأمعاء المشرحة لديدان التحوير lipl-4 ، المكملة بحمض ثنائي هومو جاما لينولينيك ، أو DGLA ، لم يتم تحفيز جينات معالجة الببتيد العصبي العصبي. مكملات DGLA بتركيزات مختلفة أنقذت تمديد العمر في الديدان عند ضربة قاضية fat-3.
يمكن أيضا معالجة الديدان مع مكملات الدهون لتسلسل الحمض النووي الريبي والبروتينات والأيض والدراسات السلوكية لتحديد الأنماط الظاهرية الإضافية في ظل هذه الظروف المحددة. يمكن تطبيق هذه المنهجية على أبحاث الشيخوخة وبيولوجيا الدهون وأي مجال بحثي آخر يهدف إلى إقامة علاقة بين نمط ظاهري معين وعامل غذائي أو مستقلب.
