秀丽隐杆线虫长寿的脂质补充和基因转录分析

该协议描述了两种脂质补充策略，结合了模式生物秀丽隐杆线虫的纵向和转录分析。该技术描述了如何使用少量蠕虫或解剖的蠕虫组织检查转录变化，以及如何将昆虫种群的液体喂养与水力技术相结合。执行此技术的个人必须练习组织解剖，因为执行实验的时间窗口很短，以实现足够的转录分析。

首先，通过在室温下以4， 000G离心过夜生长的培养物10分钟来收集OP50细菌。弃去上清液。通过涡旋将细菌沉淀悬浮在20毫升细菌稀释液，饮食限制或BDR碱中，再次重复离心10分钟。

弃去上清液后，将细菌沉淀重新悬浮在BDR培养基中以制备20X BDR细菌储备液。使用前使用BDR培养基将细菌原液稀释至5X。以乙醇或二甲基亚砜为溶剂，在新的高压灭菌玻璃小瓶中制备脂质储备溶液，并在玻璃小瓶中填充氩气或氮气以防止氧化。

将脂质储备溶液转移到BDR细菌溶液中，以在喂养条件下达到所需的最终浓度。通过涡旋20秒将其彻底混合。通过将相同体积的过滤乙醇或二甲基亚砜与BDR细菌混合来制备控制的载体。

通过将所需量的脂质或载体对照转移到 12 孔板的每个孔中进行脂质补充和液体培养，每个喂养条件重复三到四个重复。将同步的秀丽隐杆线虫悬浮液与 5X BDR 细菌以一比一的比例混合，以达到每毫升 1， 500 条蠕虫和 2.5X 细菌的最终浓度。然后将两毫升蠕虫细菌混合物转移到12孔板的每个孔中。

完成后，用箔纸包裹12孔板，并在20摄氏度的培养箱中以100 RPMM摇动板以获得所需的孵育长度。为了在平板上补充脂质，将一毫升脂质条件细菌接种到10厘米线虫生长培养基或NGM琼脂平板的中心。在使用大量板时，确保最终工作溶液在播种两个板之间多次涡旋。

在生物安全罩内的黑暗中干燥板。将3000条蠕虫从同步蠕虫培养物转移到10厘米的平板上。在生物安全罩中干燥板，直到在补充脂质的平板上游泳的蠕虫开始爬行。

干燥后，将脂质调节板在20摄氏度的培养箱中孵育所需的时间长度，如果使用多不饱和脂质，则保护板免受光照。通过在PCR管中将0.2微升DNase I与19.8微升裂解液混合，为每个样品制备20微升最终裂解溶液，并通过上下移液五次充分混合。为了从少量的全蠕虫中提取RNA，通过将15至20条蠕虫从细菌草坪转移到新鲜未播种的NGM板上来去除细菌。

将15至20个蠕虫从未接种的NGM板转移到含有20微升新鲜制备的具有最少细菌数量的最终裂解溶液的PCR管中，并在室温下孵育裂解反应5分钟。孵育结束后，将样品保存在一个漂亮的冷水浴中，并探测蠕虫四次，每次五秒，每次振幅为30%，每次超声处理之间脉冲15秒。将试管在室温下孵育五分钟，然后将两微升终止溶液加入裂解反应中，并通过轻轻敲击混合。

将反应在室温下孵育两分钟，然后将试管放在冰上。为了从蠕虫组织中提取RNA，从细菌草坪上挑选大约20条蠕虫，并将它们放入新鲜的未播种NGM板中以去除蠕虫中的细菌。将细菌尽可能少的20条蠕虫转移到含有500微升M9溶液的手表玻璃杯中，该表杯含有4微摩尔左旋咪唑。

当蠕虫被固定时，使用可以连接到一毫升注射器的 25 号针头解剖种系或肠道。使用高压灭菌的玻璃移液管，将解剖的组织转移到PCR管中，并将管在冰上放置两分钟，使材料沉积在底部。在加入20微升终裂解溶液之前，从PCR管中取出上清液，并通过敲击将其充分混合。

将裂解反应孵育五分钟后，加入两微升终止液并多次敲击试管。将试管孵育两分钟，然后再进行逆转录。在验证研究中，从大量种群和少数蠕虫中提取的RNA显示出神经肽加工基因egl-3和egl-21的相似诱导。

这表明从少数蠕虫中提取RNA可以作为来自大量种群的标准CDNA合成技术的有效替代方案。在补充二高γ-亚麻酸（DGLA）的lipl-4转基因蠕虫的解剖肠中，未诱导神经元神经肽加工基因。不同浓度的DGLA补充剂挽救了Fat-3敲低后蠕虫寿命延长。

补充脂质的蠕虫也可以用于RNA测序，蛋白质组学，代谢组学和行为研究，以识别这些特定条件下的其他表型。这种方法可以应用于衰老研究，脂质生物学和任何其他旨在建立某种表型与营养因子或代谢物之间关系的研究领域。