Ce protocole décrit deux stratégies de supplémentation en lipides avec une combinaison d’analyses longitudinales et transcriptionnelles dans l’organisme modèle, C. elegans. La technique décrit comment examiner les changements transcriptionnels en utilisant quelques vers ou tissus de vers disséqués et comment l’alimentation liquide d’une population d’insectes pourrait être couplée à des techniques hydroélectriques. Les personnes qui effectuent cette technique doivent pratiquer la dissection tissulaire en raison de la courte fenêtre de temps pour effectuer l’expérience afin d’obtenir une analyse transcriptionnelle adéquate.
Pour commencer, prélevez les bactéries OP50 en centrifugeant la culture cultivée pendant la nuit à 4 000 g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant. Suspendre la pastille bactérienne dans 20 millilitres de dilution bactérienne, de restriction alimentaire ou de base BDR par vortex et répéter la centrifugation pendant 10 minutes.
Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille bactérienne dans le milieu BDR pour préparer un stock bactérien BDR 20 X. Diluer le stock de bactéries à 5X à l’aide d’un milieu BDR avant utilisation. En utilisant de l’éthanol ou du diméthylsulfoxyde comme solvant, préparer une solution mère de lipides dans un nouveau flacon en verre autoclavé et remplir le flacon en verre avec de l’argon ou de l’azote pour éviter l’oxydation.
Transférer la solution mère lipidique dans la solution bactérienne BDR pour obtenir la concentration finale souhaitée dans les conditions d’alimentation. Bien mélanger en tourbillonnant pendant 20 secondes. Préparer le véhicule contrôlé en mélangeant les mêmes volumes d’éthanol filtré ou de diméthylsulfoxyde avec des bactéries BDR.
Effectuer la supplémentation lipidique et la culture liquide en transférant la quantité désirée de lipides ou de contrôle du véhicule à chaque puits d’une plaque de 12 puits avec trois à quatre répétitions pour chaque condition d’alimentation. Mélanger la suspension synchronisée de vers Caenorrhabditis elegans avec 5X bactéries BDR dans un rapport de un à un pour obtenir une concentration finale de 1 500 vers par millilitre et 2,5X pour les bactéries. Ensuite, transférez deux millilitres du mélange de bactéries de vers dans chaque puits de la plaque de 12 puits.
Lorsque vous avez terminé, enveloppez la plaque de 12 puits avec du papier d’aluminium et agitez la plaque dans un incubateur à 20 degrés Celsius à 100 tr / min pour la durée d’incubation souhaitée. Pour la supplémentation en lipides sur plaques, ensemencez un millilitre de bactéries conditionnées par les lipides au centre d’un milieu de croissance de nématodes de 10 centimètres ou d’une plaque de gélose NGM. Assurez-vous que la solution de travail finale est vortex plusieurs fois entre l’ensemencement des deux plaques lorsque vous travaillez avec un grand nombre de plaques.
Sécher l’assiette dans l’obscurité à l’intérieur d’une hotte de biosécurité. Transférer 3000 vers de la culture de vers synchronisée vers la plaque de 10 centimètres. Sécher la plaque dans une hotte de biosécurité jusqu’à ce que les vers qui nageaient sur les plaques supplémentées en lipides commencent à ramper.
Une fois séchée, incuber la plaque conditionnée en lipides dans un incubateur à 20 degrés Celsius pendant la durée souhaitée et, si vous utilisez des lipides polyinsaturés, protégez la plaque de la lumière. Préparer 20 microlitres de solution de lyse finale pour chaque échantillon en mélangeant 0,2 microlitre de DNase I avec 19,8 microlitres de solution de lyse dans un tube de PCR et bien mélanger en pipetant de haut en bas cinq fois. Pour extraire l’ARN du petit nombre de vers entiers, éliminez les bactéries en transférant 15 à 20 vers de la pelouse bactérienne vers une plaque NGM fraîchement non ensemencée.
Transférer 15 à 20 vers de la plaque NGM non ensemencée vers le tube PCR contenant 20 microlitres de la solution de lyse finale fraîchement préparée avec le nombre minimum de bactéries et incuber la réaction de lyse pendant cinq minutes à température ambiante. Une fois l’incubation terminée, conservez l’échantillon dans un bon bain d’eau froide et sondez les vers quatre fois, cinq secondes à chaque fois avec une amplitude de 30% et une impulsion pendant 15 secondes entre chaque moment de sonication. Incuber le tube à température ambiante pendant cinq minutes avant d’ajouter deux microlitres de solution stop dans la réaction de lyse et mélangez-le en tapotant doucement.
Incuber la réaction pendant deux minutes à température ambiante, puis mettre le tube sur de la glace. Pour extraire l’ARN du tissu du ver, choisissez environ 20 vers de la pelouse bactérienne et placez-les dans une plaque NGM fraîche non ensemencée pour éliminer les bactéries des vers. Transférez 20 vers avec le moins de bactéries possible dans un verre de montre contenant 500 microlitres de solution M9 contenant quatre lévamisoles micromolaires.
Lorsque les vers sont immobilisés, disséquez la lignée germinale ou l’intestin à l’aide d’une aiguille de calibre 25 qui peut être attachée à la seringue d’un millilitre. À l’aide d’une pipette en verre autoclavée, transférer les tissus disséqués dans le tube PCR et déposer le tube sur de la glace pendant deux minutes permettant le dépôt du matériau au fond. Retirez le surnageant du tube de PCR avant d’ajouter 20 microlitres de solution de lyse finale et mélangez-le bien en tapotant.
Après avoir incubé la réaction de lyse pendant cinq minutes, ajoutez deux microlitres de solution d’arrêt et tapotez le tube plusieurs fois. Incuber le tube pendant deux minutes avant de procéder à la transcription inverse. Dans l’étude de validation, l’ARN extrait d’une grande population et quelques vers ont montré une induction similaire des gènes de traitement des neuropeptides, egl-3 et egl-21.
Cela suggère que l’extraction de l’ARN de quelques vers peut être une alternative valable aux techniques standard de synthèse de l’ADNC à partir de grandes populations. Dans l’intestin disséqué des vers transgéniques lipl-4, complétés par de l’acide dihomo-gamma-linolénique, ou DGLA, les gènes de traitement neuropeptidique neuronal n’ont pas été induits. La supplémentation en DGLA à différentes concentrations a sauvé l’extension de la durée de vie chez les vers lors de l’élimination de la graisse 3.
Les vers avec supplémentation en lipides peuvent également être traités pour le séquençage de l’ARN, la protéomique, la métabolomique et les études comportementales pour identifier des phénotypes supplémentaires dans ces conditions spécifiques. Cette méthodologie peut être appliquée à la recherche sur le vieillissement, à la biologie des lipides et à tout autre domaine de recherche visant à établir une relation entre un certain phénotype et un facteur nutritionnel ou un métabolite.
