Этот протокол описывает две стратегии добавления липидов с комбинацией продольного и транскрипционного анализа в модельном организме C.elegans. Метод описывает, как исследовать транскрипционные изменения с использованием нескольких червей или рассеченных тканей червей и как жидкое кормление популяции насекомых может быть связано с гидротехническими методами. Лица, выполняющие эту технику, должны практиковать рассечение тканей из-за короткого промежутка времени для выполнения эксперимента для достижения адекватного транскрипционного анализа.
Для начала соберите бактерии OP50 путем центрифугирования выращенной на ночь культуры при 4000 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант. Приостановить бактериальную гранулу в 20 миллилитрах бактериального разведения, диетического ограничения или основания BDR путем вихря и снова повторить центрифугирование в течение 10 минут.
После выброса супернатанта повторно суспендируйте бактериальную гранулу в среде BDR, чтобы приготовить бактериальный запас 20 X BDR. Разбавьте бактериальный запас до 5X, используя среду BDR перед использованием. Используя этанол или диметилсульфоксид в качестве растворителя, приготовьте раствор липидного сырья в новом автоклавном стеклянном флаконе и заполните стеклянный флакон аргоном или азотом для предотвращения окисления.
Перенесите раствор липидного сырья в раствор бактерий BDR для достижения желаемой конечной концентрации в условиях кормления. Тщательно перемешайте его, вихря в течение 20 секунд. Подготовьте контролируемое транспортное средство путем смешивания одинаковых объемов фильтрованного этанола или диметилсульфоксида с бактериями BDR.
Выполняйте липидные добавки и культивирование жидкости путем переноса желаемого количества липидов или контроля транспортного средства в каждую лунку из 12-луночной пластины с тремя-четырьмя репликами для каждого условия кормления. Смешайте синхронизированную суспензию червя Caenorrhabditis elegans с 5X бактериями BDR в соотношении один к одному, чтобы достичь конечной концентрации 1 500 червей на миллилитр и 2,5X для бактерий. Затем переложите два миллилитра смеси червячных бактерий в каждую лунку 12-луночной пластины.
Когда закончите, оберните 12-луночную пластину фольгой и встряхните пластину в инкубаторе с температурой 20 градусов цельсия при 100 об/мин для желаемой длины инкубации. Для липидных добавок на пластинах помените один миллилитр липидных кондиционированных бактерий в центр 10-сантиметровой среды роста нематоды или агаровой пластины NGM. Убедитесь, что окончательное рабочее решение многократно завихряется между посевом двух пластин при работе с большим количеством пластин.
Высушите пластину в темноте внутри вытяжки биобезопасности. Перенесите 3000 червей из синхронизированной червячной культуры на 10-сантиметровую пластину. Высушите пластину в вытяжке биобезопасности до тех пор, пока черви, которые плавали по пластинам, дополненным липидами, не начнут ползать.
После высыхания инкубируйте липидную кондиционированную пластину в инкубаторе с температурой 20 градусов Цельсия в течение желаемого периода времени и при использовании полиненасыщенных липидов защитите пластину от света. Подготовьте 20 микролитров окончательного раствора лизиса для каждого образца, перемешав 0,2 микролитра ДНКазы I с 19,8 микролитрами раствора лизиса в ПЦР-трубке и хорошо перемешав его путем пипетирования вверх и вниз пять раз. Чтобы извлечь РНК из небольшого количества целых червей, удалите бактерии, перенеся от 15 до 20 червей с бактериального газона на свежепосеянную пластину NGM.
Переложите от 15 до 20 червей из несеянной пластины NGM в ПЦР-трубку, содержащую 20 микролитров свежеприготовленного окончательного раствора лизиса с минимальным количеством бактерий, и инкубируйте реакцию лизиса в течение пяти минут при комнатной температуре. Как только инкубация закончится, держите образец в хорошей ванне с холодной водой и исследуйте ультразвуком червей четыре раза, пять секунд каждый раз с амплитудой 30% и пульсом в течение 15 секунд между каждым временем обработки ультразвуком. Инкубируйте трубку при комнатной температуре в течение пяти минут, прежде чем добавить два микролитра стоп-раствора в реакцию лизиса и перемешайте его мягким постукиванием.
Инкубируйте реакцию в течение двух минут при комнатной температуре, а затем установите трубку на лед. Чтобы извлечь РНК из ткани червя, соберите около 20 червей с бактериального газона и поместите их в свежую несеянную пластину NGM, чтобы удалить бактерии из червей. Перенесите 20 червей с как можно меньшим количеством бактерий на часовое стекло, содержащее 500 микролитров раствора М9, содержащего четыре микромолярного левамизола.
Когда черви обездвижены, рассекните зародышевую линию или кишечник с помощью иглы 25 калибра, которая может быть прикреплена к одному миллилитровому шприцу. Используя автоклавную стеклянную пипетку, перенесите рассеченные ткани в трубку ПЦР и оседайте трубку на льду в течение двух минут, позволяя откладывать материал на дне. Извлеките супернатант из трубки ПЦР перед добавлением 20 микролитров окончательного раствора лизиса и хорошо перемешайте его постукиванием.
После инкубации реакции лизиса в течение пяти минут добавьте два микролитра стоп-раствора и несколько раз постучите по трубке. Инкубируйте трубку в течение двух минут, прежде чем перейти к обратной транскрипции. В валидационном исследовании РНК, извлеченная из большой популяции и нескольких червей, показала аналогичную индукцию генов обработки нейропептидов, egl-3 и egl-21.
Это говорит о том, что экстракция РНК из нескольких червей может быть действительной альтернативой стандартным методам синтеза CDNA из больших популяций. В рассеченном кишечнике трансгенных червей lipl-4, дополненных дигомо-гамма-линоленовой кислотой, или DGLA, гены обработки нейрональных нейропептидов не были индуцированы. Добавки DGLA в различных концентрациях спасли увеличение продолжительности жизни у червей при нокдауне жира-3.
Черви с липидными добавками также могут быть обработаны для секвенирования РНК, протеомики, метаболомики и поведенческих исследований для выявления дополнительных фенотипов в этих специфических условиях. Эта методология может быть применена к исследованиям старения, липидной биологии и любой другой области исследований, целью которой является установление связи между определенным фенотипом и питательным фактором или метаболитом.
