このプロトコルは、神経活動に関する正確な空間時間情報を提供します。この技術の主な利点は、高い空間的時間分解能で神経活動を操作および評価できることです。神経活動の異常を引き起こす精神神経疾患の病原体を説明するのに役立つ場合があります。
この方法は、他の臓器の健康だけでなく、ニューロンの研究にも適用できます。手順を実演するのは、私たちの研究室の博士課程の大学院生である郭中天です。頭部移植の翌日、脳浮腫を避けるために手術の1時間前に1キログラムあたり1.32ミリグラムのデキサメタゾンリン酸ナトリウムを腹腔内投与する。
ステレオスコープの下で、歯科用ドリルを使用して直径約2ミリメートルの円形開頭術を行います。脳の損傷を減らすために、一定のわずかな動きと軽い下向きの圧力で歯科用ドリルを慎重に操作してください。吸引システムを使用して骨片を数回取り除きます。
骨片を取り除いた後、人工脊髄液またはACSF溶液を使用して、脳の表面に残っている破片を取り除き、洗浄します。炎症反応を抑制するために、この洗浄手順を数回繰り返します。圧力注入システムを使用して、適切な圧力を設定して、先端直径10〜20マイクロメートルのガラスキャピラリーを通して500ナノリットルのAAV溶液を10分間注入します。
ガラス毛細管内のAAV溶液のレベルが徐々に低下する場合、AAV溶液は脳に投与されています。逆流を防ぐために、ガラスキャピラリーをさらに10分間そのままにしておきます。これを3回繰り返して、合計1.5マイクロリットルのAAV溶液を脳に投与します。
マイクロピペットを使用してS1の脳表面に2%低融点アガロースを塗布し、2つのカバーメガネで開頭術の上にガラス窓を置きます。カバーガラスを液体のままアガロースに押し付けます。これにより、アガロース中の気泡の形成が防止される。
頭蓋窓の端を歯科用接着性レジンセメントでシールします。ホログラフィック刺激システムを較正するには、赤色蛍光スライドの表面をサンプル面に置き、弱い励起光で顕微鏡をライブイメージングモードに設定します。キャリブレーション GUI を実行します。
mfile、パラメータペインを確認し、[保存]ボタンをクリックします。ステップ 1 ペインの [Z スキャン] ボタンをクリックすると、各平面から 2 マイクロメートル離れた 21 の異なる軸面に 3 つのランダムなスポットが自動的に生成されます。スライドバーを動かしてライブ画像を確認します。
スポットが最も小さく、最も明るく表示される完璧な平面を見つけて、[保存]ボタンをクリックします。これにより、デジタルホログラムのオフセット球面が自動的に生成されます。ステップ 2 ペインの [移動] ボタンをクリックし、左側の四角形の 6 つのスポットをクリックします。
ライブ画像を確認してください。識別可能な蛍光スポットが6つある場合は、編集ボックスにx軸とy軸を入力し、[保存]ボタンをクリックします。これにより、ホログラフィック刺激とイメージングシステム間のキャリブレーションを調整するための細かい変換係数が自動的に生成されます。
次に、ステップ3ペインの[スキャン]ボタンをクリックします。441個のデジタルホログラムを生成し、21 x 21ステップで視野全体でシングルスポットスキャンを実行します。リストボックスでパターンを変えながら画像を確認します。
レーザー出力を調整して、イメージングデバイスのダイナミックレンジ内のスポット画像を取得します。イメージングデバイスを記録モードにして、[再生]ボタンをクリックします。再生が完了したら、ステップ 4 ペインの [ウェイト マップの生成] をクリックし、スタック画像を選択します。
次に、キャリブレーションGUIウィンドウを閉じます。各スポットの不均衡な強度を補正するために、ウェイトマップが自動的に生成されます。AAVを注入したマウスにヘッドプレートを顕微鏡下に置き、ホログラフィック顕微鏡と25倍の対物レンズで920ナノメートルに調整されたモードロックチタンサファイアレーザーを使用して2光子イメージングを実行します。
ライブイメージングモードで商用イメージングソフトウェアを開きます。画像検出器の電圧とイメージングレーザーの出力を調整して、GCaMP8fを発現するニューロンの明るさを最適化します。このタンパク質を発現しているニューロンの画像をキャプチャします。
ホログラフィック照明で特定のニューロンを照らすには、SLMコントロールを実行します。m スクリプト ファイル。参照画像をクリックし、取得した画像を選択します。
次に、[スポット]ボタンをクリックして画像内のニューロンの特定のピクセルを選択し、キーボードのEnterボタンを押して確定します。イメージセンサーを用いて神経活動を高い時間分解能で検出するには、露光時間、撮像領域、ビニングを設定し、画像取得を行います。マウスを顕微鏡下に置き、2光子イメージングを実行した後、市販のイメージングソフトウェアを開きます。
ライブイメージングモードでは、画像検出器の電圧とイメージングレーザーのパワーを調整して、GCaMP-6m-p2A-ChRmineを発現するニューロンの明るさを最適化します。これらのタンパク質を発現しているニューロンの画像をキャプチャし、前に示した手順に従って特定のニューロンを照らします。第2層および第3層のニューロン内の機能的接続性を調べるには、空間光変調器を使用して光遺伝学的刺激のホログラフィックパターンを生成し、それを2光子カルシウムイメージングと組み合わせます。
皮質表面から10〜150マイクロメートルの深さで測定したイメージングレーザーの強度を920ナノメートルに設定し、視野を256マイクロメートル×256マイクロメートルに設定します。ピクセル滞留時間を 2 ヘルツの場合は 1.5 マイクロ秒、30 ヘルツの場合は 100 ナノ秒に設定します。イメージングフレームレートとして2ヘルツと30ヘルツの両方を使用して、単一のホログラフィック刺激がニューロンにカルシウム応答を引き起こしたかどうかを確認します。
単一のニューロンを刺激するホログラフィック刺激レーザーの強度を、神経活動を誘発するのに十分な10ミリワットに設定します。同時に、1040ナノメートルで10回のホログラフィック刺激を行い、ベースライン期間10秒後50ミリ秒の持続時間で8秒間隔で、920ナノメートルでのカルシウム鉄応答を画像化します。その後、マウスをホームケージに戻します。
ホログラフィック刺激とイメージセンサーを用いた100ヘルツイメージングにおけるGCaMP8fを発現するニューロンの代表的な画像と痕跡を以下に示す。このグラフは、各レーザー出力でのホログラフィック刺激に対する神経応答を示しています。ここでは、2ヘルツおよび30ヘルツのイメージングフレームレートで10種類のニューロンをホログラフィック刺激する際の代表的なカルシウム2+トレースを示します。
同じ色は同じニューロンを示します。ニューロン間の機能的接続を評価する概略図がここに示されている。オレンジ色のニューロンが刺激されると、赤色のニューロンが同時に応答し、これらのニューロン間に機能的な接続があることを示します。
野生型でGCaMP6mを発現する初代体性感覚皮質ニューロンの典型的な画像をここに示す。これらのグラフィック画像は、2ヘルツおよび30ヘルツのイメージングフレームレートでのホログラフィック刺激中の典型的なカルシウム2+トレースを表しています。ホログラフィック刺激に対する神経応答性は、2ヘルツと30ヘルツの両方のイメージング速度で検出できます。
これらのステップは、脳の動きを減らすために重要であり、2つは安定した結果を得ることです。この顕微鏡は、特定のパターンを持つニューロンを書く際に行動を誘発できると考えています。この技術により、個々のニューロンの活動を評価および操作し、神経精神医学を詳細に特徴付けることができるようになりました。
