このプロトコルにより、線維性プラーク組織のコラーゲン構造と機械的障害特性の両方の局所評価が可能になります。構造評価と機械的評価の両方が同じ組織サンプルに対して行われたため、この手法により、組織の構造評価と機械的評価の間の機能的リンクを解明することができます。線維性プラーク組織の構造と障害特性に関するこのプロトコルで得られた知識は、アテローム硬化性プラーク破裂によって引き起こされる臨床的致命的なイベントを防止および予測するための鍵となります。
まず、外科用ハサミとピンセットを使用して、動脈の縦軸に沿ってプラークを切り開きます。プラーク標本から長方形のテストサンプルを切り取り、涙や石灰化を含む組織領域を避けながら、サンプルができるだけ大きくなるようにします。次に、プラークテストサンプルを採取し、組織に針を固定して、その両端をシリコーンに固定します。
機械的試験中に引張試験装置のクランプ内にあるサンプルの領域に針を挿入します。安全メガネをかけます。サイドカッターを使用して針を短くし、サンプル表面から数ミリメートル未満突き出し、顕微鏡対物レンズの損傷を防ぎます。
サンプルが水没するまで、ペトリ皿にPBSを入れます。次に、顕微鏡システムの電源を入れ、多光子キーを回して、顕微鏡の操作ソフトウェアを開きます。試験サンプルの入ったペトリ皿を対物レンズの下に置き、顕微鏡対物レンズを下げます。
ライブスキャンモードをオンにします。スマートパネルのノブを使用して対物レンズをサンプルの隅に移動し、タイルスキャンパネルのマーク位置記号をクリックします。正しく実行すると、イメージング用に選択されたすべてのタイルを含むグリッドがオレンジ色で表示されます。
次に、画面の右下隅にある[開始]をクリックして、サンプル表面全体のタイルスキャンを作成し、サンプルジオメトリの概要を取得します。タイル スキャン後、自動的に表示される [タイル スキャン] パネルの左上のタイルの左上隅の X 座標と Y 座標を確認します。スプレッドシートでこれらの座標をメモします。
[タイル スキャン] パネルで、[スキャンフィールド] というボックスの X 方向と Y 方向のタイルの数を確認します。スプレッドシートのタイル スキャンのサイズをメモします。タイルのサイズを加算または減算して、他のタイルの座標を計算します。
タイルスキャンから、第2高調波生成またはSHGイメージングでイメージングするタイルを選択します。選択のために、クランプ内のタイルを避け、縦方向と円周方向の両方で選択した各タイルの間に1つのタイルを残します。次に、このスプレッドシートで計算された座標を使用して、画像化するタイルの位置を特定します。
指定されたボックスに座標を入力し、[Enter]をクリックして、目標が右側のタイルに移動します。ライブスキャンモードをオンにします。上部パネルのスライダーとビームパス設定を使用して多光子(MP)レーザー出力を増やし、大幅な漂白なしで可能な限り最高のレーザー出力を取得します。
次に、スマートパネルのノブを使用するか、検出器の名前とビームパス設定および追加チャネルをクリックして、検出器のゲインを調整して、飽和ピクセルのない明るい画像を取得します。検出器のゲインの一般的な値は500〜800ボルトです。スマートパネルのZ位置ノブを使用して、フォーカスプレーンを調整します。
次に、サンプルの上部に移動し、3番目のパネルの[取得]タブの下にあるZスタックパネルの矢印をクリックして、Zスタックの上部の位置を設定します。次に、SHG信号が検出されなくなるまでサンプルに焦点を合わせます。もう一度、Zスタックパネルの矢印をクリックして、この位置を設定します。
終了したら、ライブスキャンモードをオフにします。2 番目のパネルの [取得] タブで、ドロップダウン リストを使用して、スキャン速度を 400 ヘルツに保ち、ライン平均を 2 に設定し、解像度を画像あたり 512 x 512 ピクセルに設定します。双方向Xスキャンボタンをオンに切り替えます。
Zスタックパネルでzステップサイズをクリックし、ボックスに3ミクロンのzステップサイズを入力します。画面の右下隅にある[開始]をクリックして、Zスタックを作成します。完了したら、タイルの座標をファイル名に保存するか、各タイルに番号を付けます。
イメージング後、サンプルは機械的試験にさらされます。スパックルパターンを生成するには、組織染料で満たされたエアブラシを試験サンプルから約30センチメートル離して保持し、内腔表面にスプレーします。次に、一軸引張試験では、サンプルの円周方向を引張延伸方向に合わせ、サンプルの内腔側を上に向けて、サンプルを引張試験機のクランプに配置します。
ストリップの幅と長さの比率が1未満になるように初期ゲージ長が設定されていることを確認します。トルクドライバーを使用して20センチトンメートルのトルクを加えてグリップのネジを締めます。サンプルが水没するまでPBSを加熱浴に加えます。
ロードセルを引き裂き、ロードセルと引張試験機のアクチュエータからのグローバルな力と変位の測定値の記録を開始します。サンプルのたるみを取り除くために、0.05ニュートンのプレストレッチを適用してサンプルをまっすぐにします。プレストレッチの適用後のアクチュエータによるゲージ長測定に基づいて、最大10%ひずみのプレコンディショニングを10サイクル実行します。
高速度カメラでサンプルの変形のビデオを記録しながら、サンプルが完全に破損するまで一軸引張試験を開始します。故障後、グローバルな力と変位の測定値の記録を停止します。多光子顕微鏡(MPM)で得られたZスタックを画像JのSHGで開き、各Zスタックの最大強度投影(MIP)を作成します。
オープンソースのMATLABベースの繊維配向解析ツールを使用して各MIPを分析し、タイルに存在する個々のコラーゲン繊維の配向角を測定します。別の MATLAB ベースのツールである FibLab を使用して、ガウス分布を角度分布ヒストグラムに適合させます。ガウス分布プロットから、分布のモードである優勢繊維角、繊維角分布の標準偏差、異方性分率などの構造パラメータを抽出します。
カメラ画像の目視検査を実行して、破裂開始が発生したフレームを特定します。破裂場所を視覚的に特定します。引張試験中に記録されたカメラ画像を使用して、MATLABベースのソフトウェアncorrを使用してデジタル画像相関、DIC、分析を実行します。
最終延伸前の最後のフレームを基準画像として選択します。現在の画像では、最終ストレッチの開始から破断開始が発生したフレームの前の最後のフレームまでのすべての画像を選択します。サンプル表面を関心領域またはROIとして選択します。
クランプの近くにある領域を除外します。パラメータのサブセット半径を30ピクセル、サブセット間隔を3ピクセル、反復カットオフを50、差分ベクトルカットオフのノルムを10の5乗、ひずみ半径を5、自動伝搬ステップを5に設定して、DICを実行します。ncorrを使用したDIC解析から、ROIのグリーン-ラグランジュまたはオイラーひずみ分布を取得します。
これらのひずみ分布を使用して、破断前の最後のフレームにおけるプラークサンプル表面全体の平均Green-LaGrangeひずみを計算します。破断位置でのグリーン-ラグランジュひずみを計算します。テストサンプルの自然のランドマークを使用して、参照画像とタイルスキャンのオーバーレイを作成し、タイルスキャンの破裂位置を特定します。
破裂が発生した MPM-SHG タイルを特定します。MPM-SHGでスキャンしたタイルに破裂がない場合は、破裂位置に最も近いタイルを特定します。破裂が発生したタイルで見つかった構造パラメータを取得します。
涙やマクロ石灰化がほとんどまたはまったくない新鮮で無傷のプラークサンプルがここに示されています。プラークサンプルは、これらの涙や石灰化を含まない領域から採取できます。SHG イメージングとイメージの後処理は、イメージ化された各タイルから MIP を提供します。
繊維検出によるさらなる後処理により、コラーゲン構造パラメータを抽出できる繊維配向ヒストグラムが得られます。さらに、プラークサンプル全体にわたる局所構造コラーゲンパラメータを示すカラーマップが視覚的分析のために取得されます。これらの試験サンプルから、構造コラーゲンパラメータの大きなサンプル内変動が観察された。
引張試験中のプラーク組織サンプルにおける破裂の開始と伝播がここで実証されています。デジタル画像相関解析は、Green-LaGrangeひずみマップなどの局所組織変形マップを提供します。これらの菌株マップから、局所株に大きな試料内変動が観察された。
カメラの記録で破裂位置が特定されると、参照カメラ画像と顕微鏡タイルスキャンにマッピングすることができます。これにより、破裂が発生した MPM-SHG タイルと、このタイルで見つかった構造パラメータが提供されます。石灰化がなく、機械的試験に十分な大きさの線維組織サンプルを入手することは、重石灰化したプラークにとって困難な作業になる可能性があります。
機械的または構造的特徴が線維性プラーク組織障害の予測因子として特定されると、この特徴を測定するin vivoイメージングシステムにより、患者のプラーク破裂リスクを予測できるようになります。
