Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים גישה שלב אחר שלב לזיהוי וטיפול בבעיות הנפוצות ביותר הקשורות למיקרו-כניסות במיקרוסקופ כוח אטומי. אנו מדגימים את הבעיות המתעוררות על צמחי סחוס מפרקי אנושיים מקומיים המאופיינים בדרגות שונות של ניוון המונע על ידי אוסטאוארתריטיס.

Abstract

ללא ספק, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא כיום אחת הטכניקות החזקות והשימושיות ביותר להערכת מיקרו ואפילו ננו-רמזים בתחום הביולוגי. עם זאת, כמו בכל גישה מיקרוסקופית אחרת, אתגרים מתודולוגיים יכולים להתעורר. בפרט, המאפיינים של המדגם, הכנת הדגימה, סוג המכשיר, ואת הבדיקה הזחה יכול להוביל ממצאים לא רצויים. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את הבעיות המתעוררות הללו על צמחי סחוס מפרקי בריאים כמו גם ניווניים. לשם כך, אנו מראים תחילה באמצעות גישה שלב אחר שלב כיצד ליצור, לדרג ולסווג באופן חזותי דיסקיות סחוס מפרקי ex vivo לפי שלבים שונים של ניוון באמצעות הדמיה פלואורסצנטית דו-ממדית גדולה של פסיפס שלם של כל צמחי הרקמה. החוזק העיקרי של מודל ex vivo הוא בכך שהוא מורכב מסחוס אנושי זקן, ילידי, המאפשר לחקור שינויים הקשורים לדלקת מפרקים ניוונית מהתחלה מוקדמת ועד להתקדמות. בנוסף, מוצגים גם מלכודות נפוצות בהכנת רקמות, כמו גם הליך AFM בפועל יחד עם ניתוח הנתונים הבאים. אנו מראים כיצד שלבים בסיסיים אך חיוניים כגון הכנה ועיבוד דגימה, מאפייני דגימה טופוגרפיים הנגרמים על ידי ניוון מתקדם ואינטראקציה בין קצה הדגימה יכולים להשפיע על רכישת נתונים. אנו גם נתונים לבדיקה של הבעיות הנפוצות ביותר ב- AFM ומתארים, במידת האפשר, כיצד להתגבר עליהן. ידיעת מגבלות אלה היא בעלת חשיבות עליונה לאיסוף נכון של נתונים, פרשנותם, ובסופו של דבר, להטמעת הממצאים בהקשר מדעי רחב.

Introduction

בשל גודלם ההולך ומצטמצם של מכשירים ומערכות אלקטרוניים, ההתפתחות המהירה של טכנולוגיה וציוד מבוססי מיקרו וננו צברה תאוצה. מכשיר אחד כזה הוא מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), שיכול לסרוק משטחים ביולוגיים ולאחזר מידע טופוגרפי או ביומכני בקנה מידה ננומטרי ומיקרומטרי 1,2. בין התכונות העצומות שלה, כלי זה יכול להיות מופעל כמו מיקרו, כמו גם nano-indenter כדי לקבל מידע על התכונות המכניות של מערכות ביולוגיות שונות 3,4,5,6. הנתונים נאספים על ידי מגע פיזי עם פני השטח באמצעות בדיקה מכנית, אשר יכול להיות קטן כמו 1 ננומטר בקצה שלה7. העיוות שנוצר של הדגימה מוצג לאחר מכן בהתבסס על עומק הכניסה של קצה הקנטיל והכוח המופעל על הדגימה8.

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה כרונית ניוונית ארוכת טווח המאופיינת בהידרדרות הסחוס המפרקי במפרקים וברקמות הסובבות, מה שעלול להוביל לחשיפה מלאה של משטחי העצם. הנטל של OA הוא משמעותי; כיום, מחצית מכלל הנשים ושליש מכלל הגברים בגילאי 65 ומעלה סובלים מ-OA9. טראומות, השמנת יתר והביומכניקה המשתנה של המפרק10 כתוצאה מכך קובעים את ניוון הסחוס המפרקי, אשר נתפס כתוצאה סופית שכיחה. המחקר החלוצי של גנץ ועמיתיו הניח כי השלבים המוקדמים של תהליך OA עשויים לכלול את התכונות הביומכניות של סחוס11, ומאז אישרו החוקרים השערה זו12. כמו כן, מקובל כי התכונות הביומכניות של הרקמה מתוזמרות באופן פונקציונלי על ידי הארגון האולטרה-סטרוקטורלי, כמו גם קרוס-טוק תא-תא ומטריצת תא. כל שינוי יכול להשפיע באופן דרמטי על התפקוד הביומכני הכולל של הרקמה13. נכון להיום, אבחון OA הוא קליני ומבוסס על רדיוגרפיה רגילה14. גישה זו היא דו-צדדית: ראשית, היעדר סף חתך ניווני מוגדר לגיבוש האבחנה של OA מקשה על כימות, ושנית, שיטות הדמיה חסרות רגישות ותקינה ואינן יכולות לזהות נזק סחוס מקומי15,16,17. לשם כך, להערכת התכונות המכניות של הסחוס יש יתרון מכריע בכך שהיא מתארת פרמטר המשתנה במהלך OA ללא קשר לאטיולוגיה של המחלה ויש לו השפעה ישירה על תפקוד הרקמה בשלב מוקדם מאוד. מכשירי הזחה מודדים את הכוח שבו הרקמה מתנגדת להזחה. זהו, למעשה, לא מושג חדש; המחקרים המוקדמים ביותר מתוארכים לשנות ה-80 וה-90. בתקופה זו, מחקרים רבים הציעו כי מכשירי הזחה המיועדים למדידות ארתרוסקופיות של סחוס מפרקי יכולים להתאים היטב לזיהוי שינויים ניווניים בסחוס. אפילו לפני 30 שנה, כמה מחקרים הצליחו להוכיח כי מכשירי הזחה היו מסוגלים לזהות שינויים in vivo פני השטח של הסחוס במהלך ניוון רקמות על ידי ביצוע מדידות קשיחות דחיסה במהלך ארתרוסקופיה18,19,20.

כניסת AFM (AFM-IT) של הסחוס המפרקי מספקת מידע על תכונה מכנית מרכזית של הרקמה, כלומר נוקשות. זהו פרמטר מכני המתאר את הקשר בין עומס מוחל, לא הרסני לבין העיוות שנוצר כתוצאה מכך של אזור הרקמה המושקעת21. AFM-IT הוכח כמסוגל לכמת שינויים תלויי גיל בנוקשות ברשתות קולגן מקרוסקופיות שאינן מושפעות, ובכך להבדיל בין השינויים הפתולוגיים הקשורים להופעת OA (דרגה 0 בסולם Outerbridge בסחוס מפרקי)22. הראינו בעבר כי AFM-ITs, על בסיס ארגון כונדרוציטים מרחביים כסמן ביולוגי מבוסס תמונה לניוון סחוס מוקדם, מאפשרים לא רק לכמת אלא גם לאתר בפועל את השינויים המכניים הניווניים המוקדמים ביותר. ממצאים אלה כבר אושרו על ידי אחרים23,24. לפיכך, AFM-IT פועל ככלי מעניין לאבחון וזיהוי שינויים ניווניים מוקדמים. שינויים אלה ניתנים למדידה כבר ברמה התאית, ומעצבים מחדש את ההבנה של התהליך הפתופיזיולוגי OA.

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים הליך דירוג היסטולוגי וביומכני מלא של צמחי סחוס מפרקיים, החל מהכנת צמחי סחוס מקומיים ועד לרכישה ועיבוד של נתוני AFM. באמצעות גישה שלב אחר שלב, אנו מראים כיצד ליצור, לדרג ולסווג חזותית רקמת סחוס מפרקי לפי שלבים שונים של ניוון באמצעות דימות פסיפס גדול דו-ממדי, ואחריו כניסות מיקרו-AFM.

למרות שכיום, AFM-IT הוא אחד הכלים הרגישים ביותר למדידת שינויים ביומכניים בסחוס7, כמו כל טכניקה אינסטרומנטלית אחרת, יש לו מגבלות ומוזרויות מעשיות25 שיכולות להוביל לרכישת נתונים שגויה. לשם כך, אנו בוחנים את הבעיות הנפוצות ביותר המתעוררות במהלך מדידות AFM של צמחי הסחוס ומתארים, במידת האפשר, כיצד למזער או להתגבר עליהן. אלה כוללים היבטים טופוגרפיים של הדגימות והקשיים לייצב אותן בסביבה תואמת AFM, מוזרויות פיזיות של פני הרקמה, והקשיים הנובעים מכך בביצוע מדידות AFM על משטחים כאלה. מוצגות גם דוגמאות לעקומות כוח מרחק שגויות, המדגישות את התנאים שעלולים לגרום להן. כמו כן נדונות מגבלות נוספות הטבועות בגיאומטריה של קצה הקנטיליבר ובשימוש במודל הרץ לניתוח הנתונים.

Protocol

נעשה שימוש בקונדילים של עצם הירך שנאספו מחולים שעברו ניתוח ארתרופלסטי כולל של הברך בבית החולים האוניברסיטאי של טובינגן, גרמניה. במחקר זה נכללו רק דגימות סחוס מפרקי מחולים עם פתולוגיות מפרקים ניווניות ופוסט-טראומטיות. אישור ועדת האתיקה המחלקתית, המוסדית והמקומית התקבל לפני תחילת המחקר (פרויקט מס' 674/2016BO2). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני ההשתתפות.

הערה: תרשים זרימה של שלבי הניסוי בסדר הכרונולוגי שלהם מוצג באיור 1.

1. עיבוד רקמות ויצירת דיסקי סחוס

  1. הכנת רקמות
    1. לאחר כריתה לאחר הניתוח, הניחו את דגימות הסחוס במיכל מלא בתווך הנשר של דולבקו (DMEM) בתוספת 5% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין. ודא שהדגימות שקועות לחלוטין בתווך. משך הזמן בין כריתה כירורגית לעיבוד נוסף של הסחוס לא יעלה על 24 שעות. ודא שלאורך כל העיבוד, הדגימות שקועות במלואן במדיה כדי למנוע התייבשות דגימה.
    2. חותכים את הסחוס מהעצם באמצעות אזמל.
  2. יצירת דיסק סחוס
    1. יצירת דיסקי סחוס בקוטר 4 מ"מ באמצעות ניקוב ביופסיה.
      הערה: חשוב לבחור ולכרות את אזורי הקונדיל שבהם עובי שכבת הסחוס עולה על 1 מ"מ. זה עלול להיות בעייתי, במיוחד סביב אזורי נשיאת עומס, שבהם שכבת הסחוס בדרך כלל מאבדת את עוביה עקב תהליכי בלאי או התנוונות.
    2. הניחו את דיסקיות הסחוס בקוטר 4 מ"מ שנוצרו קודם לכן על מכשיר חיתוך בהתאמה אישית וקיבעו והחזיקו את דיסקיות הסחוס יציבות באמצעות מרית. בעת הנחת דיסקיות הסחוס על מכשיר החיתוך, יש להקפיד על כך. מקמו את הדגימות כך שהשכבה העליונה של הסחוס (האזור השטחי של הסחוס המפרקי) לא תפנה אל הלהב
    3. חותכים את דיסקיות הסחוס עם סכין גילוח. דגימות סחוס בצורת דיסק של 4 מ"מ x 1 מ"מ נוצרות, אם כן. כדי למנוע התייבשות דגימה, בצע חיתוך רקמות במהירות האפשרית.
    4. אסוף כל דיסק בעזרת מרית ומקם את דיסקי הסחוס שנוצרו לתוך צינורות 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל DMEM בתוספת 5% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין. מניחים כ-15 דיסקים בצינור אחד.
  3. חתך קריוטום של דיסקי הסחוס (לפרוסות מאונכות)
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי, וניתן להשתמש בו אם יש צורך בהדמיה צדדית של התפלגות התבנית התאית בתוך דיסקי הסחוס. זה יכול לשמש כשיטת אימות כמו התפלגות של דפוס סלולרי הוא תכונה 3D של סחוס מפרקי26. ניתן להשתמש גם בחתך אופטי ושחזורים תלת ממדיים של כל דיסקיות הסחוס באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ובכך להסיר את הצורך לחתוך את הדגימות כמתואר בפרוטוקול.
    1. מכסים את דיסק הסחוס בתווך הטבעה מסיס במים ומניחים אותו על קצהו על ידית ההקפאה (כאשר פני השטח של הדיסק מאונכים לפני השטח של הידית). במכשיר ההקפאה, מדיום ההטבעה קופא בטמפרטורות נמוכות.
    2. באמצעות קריוטום סטנדרטי, חתכו את הרקמה הצידה בעובי של 60 מיקרומטר עד שמגיעים לאמצע הדיסק (כלומר, כאשר הקריוסקציות מגיעות לאורך של 4 מ"מ) ואספו את הפרוסות. על ידי חתך הדיסק בניצב ניתן לדמיין את כל אזורי הסחוס (שטחי, אמצעי ועמוק).
    3. אספו את המקטעים על מגלשת זכוכית והסירו את אמצעי ההטבעה המסיס במים על ידי שטיפה שלוש פעמים במי מלח חוצצי פוספט (PBS).

2. מיון דיסק סחוס כפונקציה של התבנית המרחבית התאית

  1. צביעת דגימות הסחוס בצורת דיסק
    1. מניחים דיסק סחוס אחד (סעיף 1.2) בכל באר של צלחת בת 96 בארות ומוסיפים 130 מיקרוליטר של צבע פלואורסצנטי חדיר לתאים בדילול של 1:1,000 לכל באר.
    2. בדקו ויזואלית את הצלחת כולה וודאו שבכל באר מונח דיסק אחד בלבד. לדגור על הצלחת במשך 30 דקות באינקובטור תרבית התאים הסטנדרטי ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. צביעת פרוסות סחוס 60 מיקרומטר
    1. מניחים בעדינות את קטעי דיסק הסחוס (סעיף 1.3) על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בעזרת מלקחיים.
    2. כסו את חלקי הסחוס באמצעי הרכבה המכיל צביעה נגדית גרעינית מסוג DAPI והניחו בעדינות כיסויים המתאימים למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    3. אטמו את הקצוות של כל כיסוי בלק שקוף רגיל והניחו לו להתייבש במשך 3 דקות.
  3. מיון והדמיה של סחוס מלמעלה למטה ומהצד
    הערה: יש לבדוק כל דיסק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מטרת שלב זה היא למיין את הדיסקים על פי התבנית התאית השלטת בהם (מחרוזות בודדות, מחרוזות כפולות, אשכולות קטנים, אשכולות גדולים או מפוזרים).
    1. הניחו את הצלחת בעלת 96 הבארות על מחזיק הצלחת במיקרוסקופ הפלואורסצנטי.
    2. בחר את מסנן הפלואורסצנטיות המתאים של Em 495 nm/Ex 515 nm (להדמיה מלמעלה למטה של דיסקי הסחוס שהוכנו בסעיף 2.1.) או Em 358 nm/Ex 461 nm (להדמיית צד של מקטעי הסחוס שהוכנו בסעיף 2.2) ואת המטרה 10x.
      הערה: השימוש במטרה 10x מאפשר לבדוק את כל היקף הדיסק, וניתן לשלול דגימות עם צביעה לא הומוגנית או לא נכונה. עם זאת, שימוש רק במבט מלמעלה למטה עשוי לגרום לתפיסה של שינויים בארגון התא כתוצאה מניתוח שכבות הרקמה העמוקות יותר הנראות לתצפית מלמעלה למטה על ידי שחיקה שטחית. לדוגמה, מחרוזת עולה בעקבות ארקדות הקולגן יכולה להיתפס כתא בודד או תאים מפוזרים (תבנית מפוזרת)26. כתוצאה מכך, יש לבדוק את שני צידי הדיסקים כדי להבטיח בחירה נכונה של תבניות סלולריות.
    3. קבע חזותית את התבנית התאית המוצגת בכל דיסק סחוס. אין זה סביר כי דיסק יהיה רק סוג אחד של דפוס סלולרי. עבור החלק של הדיסק שבו סידור הכונדרוציטים אינו תואם את תבנית העניין, קבל את הדגימות רק אם התבנית הבלתי רצויה נמצאת ממש בפריפריה, שם מדידות AFM אינן מתבצעות (כלומר, עד 0.5 מ"מ מגבול הדיסק), וודא שזה לא יעלה על 10% מכלל פני השטח של הדיסק27, 28.
  4. רכישת תמונה של כל דיסקי הסחוס
    1. בחר את המטרה 10x של המיקרוסקופ ומקם אותו מתחת לבאר שנבחרה מראש המכילה דיסק סחוס בודד. התמקדו בדיסק כדי לראות את התבנית התאית.
    2. בחר את פונקציית הנווט כדי לקבל סקירה כללית של הבאר כולה. השתמש בלחצן העכבר השמאלי וגרור כדי לנווט למיקום במה אחר. באמצעות גלגל העכבר, הגדל והקטן את התצוגה.
      הערה: בשלב זה, תצוגה מקדימה של הבאר עם המדגם כולו ניתן לראות על ידי לחיצה כפולה על כל אזור עניין ברצף.
    3. בחר ריבוע המקיף את אזור העניין לסריקה; בשלב זה, כל האריחים הבודדים המרכיבים את הפסיפס יהיו גלויים.
    4. התאם את עוצמת החשיפה/האור כך שניתן יהיה להמחיש בבירור את התאים מהרקע. בשלב זה, הבהירות/ניגודיות של התמונה הותאמה עבור כל האריחים ולא ניתן עוד להתאים אותה בנפרד עבור כל אריח.
      הערה: מכיוון שהתאים הסמוכים לקצה הדיסק פולטים לעתים קרובות אות פלואורסצנטי גבוה יותר מאשר התאים שבמרכז, יש להתאים את הגדרות החשיפה/עוצמת האור.
      1. כדי להעריך אם זמן החשיפה מתאים לערוץ מסוים, בדוק את התפלגות האות בהיסטוגרמה. על ידי שימוש במנגנון החשיפה האוטומטי הכלול בתוכנת התמונה של המיקרוסקופ, דמיינו את כל התאים השוכנים בתוך הדיסק.
    5. בחר באפשרות נקודת מפת מיקוד של התוכנה ולאחר מכן בחר כל אריח בנפרד על-ידי לחיצה שמאלית במרכזו.
    6. בחר באפשרות מפת מיקוד. מוצג חלון עם כל האריחים שנבחרו קודם לכן. לחץ פעמיים על אריח ברשימה כדי להציג אותו ולמקד אותו כראוי.
    7. לחץ על הגדר Z כדי לשמור את תוכנית המוקד ולהמשיך לאריח הבא. לאחר התאמת תוכנית המוקד עבור כל אריח בודד, התחל ברכישת תמונה על-ידי הקשה על התחל סריקה.
      1. אם הסריקה מציגה פסים אופקיים ו/או אנכיים כהים יותר, ייתכן שהסיבה לכך היא תאורה לא נכונה ולא אחידה של המסגרות הבודדות. פתור זאת באמצעות האפשרות הצללה מקושרת המשולבת בתוכנה לפני הסריקה בפועל.
    8. שמור, ייצא והוסף ביאורים נכונים לתמונות.

3. גישה ביומכנית של צמחי סחוס

  1. הכנת דוגמאות למדידות AFM
    1. תקן כל דיסק סחוס שנבחר מראש המכיל תבנית תאית (סעיף 2) בצלחות פטרי באמצעות דבק תואם ביולוגית. הוסף דבק לדוגמה מספיק בצד העליון, התחתון, השמאלי והימני של הדיסק.
    2. מכסים את הדיסקים ב-2.5 מ"ל של מדיום L-15 של לייבוביץ' ללא L-גלוטמין. מוסיפים את תווך ליבוביץ בעדינות על הדגימות כדי למנוע ניתוק דגימה מפני השטח עקב גלים שנוצרו על ידי התווך.
  2. טעינת הדגימות ל-AFM
    1. מקמו את צלחת הפטרי במחזיק הדגימות של מכשיר ה-AFM והפעילו את מחמם צלחת הפטרי המכוון ל-37°C. תנו לצלחת תרבית הרקמה להגיע לטמפרטורה הרצויה. זה נעשה כדי למנוע ממצאים אפשריים הנגרמים על ידי שינוי טמפרטורה.
  3. כיול AFM-cantilever
    1. אתחל את הגדרת התוכנה כפי שתוארה קודם לכן על-ידי Danalache et al.29.
    2. בחר מחזיק בלוק זכוכית מתאים למדידות נוזלים והנח אותו בזהירות על ראש AFM. מנגנון נעילה מאבטח את בלוק הזכוכית בראש AFM. ודא שהמשטח המחזיר אור של בלוק הזכוכית ישר ומקביל למחזיק AFM.
    3. הניחו את המזנון על פני השטח של מחזיק המגן מבלוק הזכוכית בזהירות. המזנון עצמו צריך להישען על המישור האופטי המלוטש, במרכז גוש הזכוכית.
    4. מניחים בזהירות חצאית סיליקון (קרום סיליקון) על בסיס מחזיק המגן על מנת למנוע עיבוי בינוני בראש AFM.
    5. מנמיכים את המזנון בצעדים של 100 מיקרומטר באמצעות פונקציית מנוע הצעד עד שהוא שקוע לחלוטין בתווך.
    6. הפעל גישת סורק עם פרמטרי הגישה המתוארים על ידי Danalache et al.29. משכו את המזנון ב-100 מיקרומטר ברגע שמגיעים לתחתית צלחת הפטרי.
    7. כייל את המזנון באמצעות השלבים המדויקים והפעל את הפרמטרים המתוארים על ידי Danalache et al.29. בסוף הכיול, הסטייה האנכית נשמרת ומוצגת ביחידות כוח של ניוטון (N) ולא בוולט (V) - יחידת הרישום המקורית על ידי גלאי הפוטודיודות. בניסויים כאן, נקודה קבועה של 4.47 nN התקבלה לאחר כיול.
    8. באמצעות פונקציית מנוע הצעד, משוך את המגן ל- 1,000 מיקרומטר.
  4. זיהוי אתר מדידת הסחוס הרצוי תחת AFM
    הערה: בשל עובי של 1 מ"מ של דיסקיות הסחוס, הקנה אינו נראה בשדה הראייה בעת ניווט מעל הדגימה.
    1. השתמש במצלמת CCD של המיקרוסקופ כדי לזהות את הקנטילבר. יש למקם את מיכל ה-AFM באזור נטול דגימות של צלחת הפטרי.
    2. התחל גישה של סורק עם המזנון על אזור נקי וללא דגימות של צלחת הפטרי, תוך שימוש באותם פרמטרים שתוארו על ידי Danalache et al.29.
    3. משכו עוד יותר את המגן במרחק של 1.5 מ"מ מתחתית הצלחת בעזרת בקרת מנוע הצעד. שלב זה הוא קריטי על מנת למנוע התנגשות ישירה בין הקנטיל לבין הדגימה.
    4. עבור משדה בהיר לתצוגת פלואורסצנטיות וזהה חזותית את החלק העליון של הדיסק.
    5. הזז את מחזיק דגימת ה-AFM בדיוק 2 מ"מ לכיוון מרכז הדיסק. נקודה זו נחשבת למרכז דיסק הסחוס.
    6. הפעל גישה סורק, ולאחר שמגיעים לפני השטח של דיסק הסחוס, משוך את המשטח ב -100 מיקרומטר.
  5. מדידות עקומת מרחק כוח
    1. התמקדו בתאים הממוקמים באתר המדידה הרצוי. לחץ על לחצן הפעלה כדי להתחיל את המדידות ואת יצירת עקומות מרחק הכוח במיקום היעד.
    2. קבל חמש עקומות מרחק כוח בכל אתר מדידה. משכו את הקנטיל ב-500 מיקרומטר והזיזו אותו לאתר המדידה הבא.
      הערה: נסיגת הקנטיליבר היא שלב מכריע, מכיוון שמשטח דיסק הסחוס אינו הומוגני ויש לו אי סדירות. הילוך גבוה על פני הדגימה עלול לגרום להתנגשות דרמטית, שתוביל לנזק לא רצוי לחוד/דגימה. אנו ממליצים לבחור לפחות חמישה אתרי מדידה שונים המפוזרים על פני השטח של הדיסק ולרכוש לפחות חמש עקומות מרחק כוח בכל אתר.
    3. בדוק את עקומות מרחק הכוח ושמור אותן.
  6. הערכת המודולים של יאנג באמצעות מודל ההתאמה של הרץ
    1. פתח את עקומות מרחק הכוח שנוצרו לניתוח (קובץ .jpk) בתוכנת ניתוח הנתונים באמצעות האפשרות Open a Batch of Spectroscopy Curves .
    2. בחר את דגם התאמת הרץ ולאחר מכן בחר באפשרות התאמת גמישות .
      1. האפשרות Elasticity Fit מבצעת אוטומטית את החישובים הבאים בעקומת מרחק הכוח שנבחרה: מחשבת את קו הבסיס ומפחיתה מהעקומה כולה כדי להסיר את הסטת קו הבסיס (קו הבסיס מוחזר לאפס בציר y); קובע את נקודת המגע על ידי זיהוי הנקודה שבה עקומת מרחק הכוח חוצה את קו הכוח אפס (נקודת המגע מוגדרת לאפס על ציר X); חישוב הפרדת קצה מדגם (אות הגובה של piezo חשבונאות עבור כיפוף של cantilever מופחת); ומתאימה את עקומת מרחק הכוח באופן אוטומטי לדגם שנבחר. אם תרצה, כל אחד מהשלבים הללו יכול להתבצע גם באופן עצמאי.
    3. התאימו באמצעות פרמטרי ההתאמה הבאים: יחס פואסון של 0.5 ורדיוס קצה הקנטיליבר המתאים.
      הערה: בעת שימוש במקל עם קצה כדורי, יש להשתמש במודל Hertz Fit. הקנטיליבר ששימש במחקר זה היה בעל קצה כדורי ברדיוס של 5 מיקרומטר. אנו ממליצים להתאים את עקומת מרחק הכוח עד להשגת הכוח המרבי המופעל (setpoint).
    4. בדוק חזותית את התאמת עקומת מרחק הכוח כדי לוודא נכונות. שלב זה צריך להיעשות עבור כל אחת מעקומות מרחק הכוח שנותחו.
  7. קביעת עומק הזחה
    הערה: בהתאם לכלי ניתוח הנתונים שבו נעשה שימוש, תהליך זה עשוי להשתנות. הנסיין יכול לקרוא בקלות את עומק הכניסה על ידי ביצוע סדרה של צעדים הכלולים בתוכנית ניתוח הנתונים.
    1. פתח כל אחת מעקומות מרחק הכוח שנוצרו בתוכנת ניתוח הנתונים ובחר את Hertz fit Model כתהליך הניתוח.
    2. החילו את האפשרות ' הסט מקו בסיס' 'הפחת ' על אפס ציר הסטייה האנכית (ציר y) ובחרו בפונקציה 'הסטה + הטיה '.
    3. השתמש בפונקציה Find Contact Point כדי לזהות באופן אוטומטי את נקודת המגע, המועברת באופן אוטומטי לקואורדינטת x של אפס.
    4. הפחת את המרחק תוך התחשבות אך ורק בסטייה מגובה הפיזו הגולמי במהלך הכניסה באמצעות הפונקציה מיקום קצה אנכי .
    5. בחרו באפשרות 'התאמת גמישות ' להצגת עקומת מרחק הכוח המעובדת ובחרו באזור התרשים כך שהוא יתיישר עם הערך השלילי ביותר בציר מיקום הקצה האנכי (ציר x).
    6. קרא ותעד את הכניסה מהתיבה X Min בכרטיסיית הפרמטרים. שמור ותעד את התוצאות.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. פתח את התוכנה הסטטיסטית. בחר ערכת נתונים חדשה מהתפריט הנפתח.
  2. פתח את הכרטיסייה תצוגת משתנים לאחר בחירת קובץ ערכת הנתונים . הגדירו את המשתנים המספריים לכל קטגוריית תבניות תאיות: מחרוזות בודדות = SS, מחרוזות כפולות = DS, אשכולות קטנים = SC, אשכולות גדולים = BC, מפוזרים ומודולים של יאנג.
  3. בכרטיסייה תצוגת נתונים, הזן את נתוני המודולים של יאנג הנמדדים עבור כל אחת מקטגוריות התבניות הסלולריות המתאימות. נתח את התפלגות הנתונים על-ידי בחירה באפשרות נתח משורת התפריטים ולאחר מכן ניתוח נתונים גישוש.
  4. בחר מודולי יאנג כמשתנה התלוי ותבנית תאית כרשימת הגורמים. תרשים תיבה המשמש למקטע התוצאות מוצג בין התוצאות בקובץ הפלט.
  5. לביצוע ניתוח סטטיסטי, בחרו 'דגימות תלויות' באזור 'בדיקה לא פרמטרית' בכרטיסיית שורת התפריטים 'נתח'. בחר מודולי יאנג כשדות בדיקה ותבנית סלולרית כקבוצות תחת הכרטיסיה שדות. לחץ על הפעל.
    הערה: התוצאות מוצגות בקובץ הפלט. לצורך הניתוח הסטטיסטי מבוצע מבחן פרידמן.
  6. שלב את ערכי ה-p של הבדיקה הלא-פרמטרית בתרשים התיבה שנוצר בשלב 4.4. שמור את התוצאות על-ידי לחיצה על קובץ בשורת התפריטים ובחירה באפשרות שמור.

תוצאות

באמצעות מכשיר חיתוך מתוצרת עצמית, הצלחנו לשתול וליצור דיסקיות סחוס קטנות (4 מ"מ x 1 מ"מ) מקונדילים אנושיים טריים המכילים תבנית מרחבית תאית אחת30 של מיתרים בודדים (SS, איור 2A), מיתרים כפולים (DS), אשכולות קטנים (SC), אשכולות גדולים (BC; איור 2A), ומפוזר (

Discussion

כמחלה מתקדמת ורב-גורמית, OA מעוררת שינויים מבניים ותפקודיים בסחוס המפרקי. במהלך OA, ליקויים בתכונות מכניות מלווים בשינויים מבניים וביוכימיים על פני השטח של הסחוס המפרקי27,31. האירועים הפתולוגיים המוקדמים ביותר המתרחשים ב- OA הם דלדול פרוטאוגליקן יחד עם הפרעה בר...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים למנתחים האורתופדיים מהמחלקה לכירורגיה אורתופדית בבית החולים האוניברסיטאי של טובינגן על מתן דגימות הרקמה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BMerck KGaA, Darmstadt, Germany1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyJPK00518
Biocompatible sample glue Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyH000033
Calcein AMCayman, Ann Arbor, Michigan, USA14948Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
CantileverBruker Nano GmbH, Berlin, GermanySAA-SPH-5UMFrequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device Self-made n/aCutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFMThe Imaging Source Europe GmbH, Bremen, GermanyDFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscopeLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyCM3050S 
Data Processing Software for the AFMBruker Nano GmbH, Berlin, Germanyn/aVersion 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, Germany11889113
Glass block cantiliver holderBruker Nano GmbH, Berlin, GermanySP-90-05Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF1315
Microscope glass slidesSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USACLS294775X50
Mounting medium With DAPIibidi GmbH, Gräfelfing, Germany50011Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-StreptomycinSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyT-05-0117
ScalpelFeather Medical Products, Osaka, Japan2023-01
Silicone SkirtBruker Nano GmbH, Berlin, Germanyn/aProtective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSSIBM, Armonk, New York, USASPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, NetherlandsSA6255012Water-soluble embedding medium 

References

  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102 (2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955 (2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247 (2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116 (2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K., Santos, N. C., Carvalho, F. A. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. , 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783 (2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409 (2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A., Olson, S. A., Gauilak, F. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. , 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -. C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467 (2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G., Subic, A. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). , 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001 (2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -. E., Lin, K. -. H., Juang, J. -. Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. . The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851 (2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

188ex vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved