Abordando Questões Práticas em Micro-Indentação Baseada em Microscopia de Força Atômica em Explantes de Cartilagem Articular Humana

Resumo

Apresentamos uma abordagem passo a passo para identificar e abordar os problemas mais comuns associados às micro-indentações por microscopia de força atômica. Exemplificamos os problemas emergentes em explantes de cartilagem articular humana nativa caracterizados por vários graus de degeneração impulsionada pela osteoartrite.

Resumo

Sem dúvida, a microscopia de força atômica (AFM) é atualmente uma das técnicas mais poderosas e úteis para avaliar micro e até mesmo nanopistas no campo biológico. No entanto, como em qualquer outra abordagem microscópica, desafios metodológicos podem surgir. Em particular, as características da amostra, a preparação da amostra, o tipo de instrumento e a sonda de recuo podem levar a artefatos indesejados. Neste protocolo, exemplificamos essas questões emergentes em explantes de cartilagem articular saudável e osteoartrítica. Para isso, primeiramente mostramos, por meio de uma abordagem passo a passo, como gerar, graduar e classificar visualmente discos de cartilagem articular ex vivo de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens de fluorescência em mosaico 2D de todo o tecido explante. A maior força do modelo ex vivo é que ele compreende cartilagem humana envelhecida, nativa, que permite a investigação de alterações relacionadas à osteoartrite desde o início precoce até a progressão. Além disso, armadilhas comuns na preparação tecidual, bem como o procedimento real de AFM juntamente com a análise subsequente dos dados, também são apresentados. Mostramos como etapas básicas, mas cruciais, como preparação e processamento de amostras, características topográficas de amostras causadas por degeneração avançada e interação amostra-ponta podem afetar a aquisição de dados. Também submetemos ao escrutínio os problemas mais comuns no AFM e descrevemos, sempre que possível, como superá-los. O conhecimento dessas limitações é de extrema importância para a correta aquisição, interpretação e, em última análise, incorporação dos achados em um amplo contexto científico.

Introdução

Devido ao tamanho cada vez menor dos dispositivos e sistemas eletrônicos, o rápido desenvolvimento de tecnologia e equipamentos baseados em micro e nano ganhou impulso. Um desses dispositivos é a microscopia de força atômica (AFM), que pode escanear superfícies biológicas e recuperar informações topográficas ou biomecânicas em escalas nano e micrométricas ^1,2. Dentre suas vastas características, essa ferramenta pode ser operada tanto como micro quanto como nano-indenter para obter informações sobre as propriedades mecânicas de diversos sistemas biológicos 3,4,5,6. Os dados são coletados pelo contato físico com a superfície através de uma sonda mecânica, que pode ser tão pequena quanto cerca de 1 nm em sua ponta⁷. A deformação resultante da amostra é então exibida com base na profundidade de indentação da ponta do cantilever e na força aplicada na amostra⁸.

A osteoartrite (OA) é uma doença crônica degenerativa de longa duração caracterizada pela deterioração da cartilagem articular nas articulações e tecidos circundantes, que pode levar à exposição completa das superfícies ósseas. O peso dos AT é substancial; atualmente, metade das mulheres e um terço de todos os homens com 65 anos ou mais sofrem de OA⁹. Traumas, obesidade e a consequente alteração biomecânica da articulação¹⁰ determinam a degeneração da cartilagem articular, que é vista como um resultado final comum. O estudo pioneiro de Ganz e col. postula que os passos iniciais do processo de OA podem envolver as propriedades biomecânicas da cartilagem¹¹ e, desde então, pesquisadores têm confirmado essa hipótese¹². Da mesma forma, é geralmente aceito que as propriedades biomecânicas do tecido são funcionalmente orquestradas pela organização ultraestrutural, bem como pelo crosstalk célula-célula e célula-matriz. Qualquer alteração pode afetar drasticamente o funcionamento biomecânico tecidual como um todo¹³. Até o momento, o diagnóstico da OA é clínico e baseado em radiografias simples¹⁴. Essa abordagem é bilateral: em primeiro lugar, a falta de um limiar de corte degenerativo definido para formular o diagnóstico de OA torna a condição difícil de quantificar e, em segundo lugar, os métodos de imagem carecem de sensibilidade e padronização e não conseguem detectar dano localizado da cartilagem^15,16,17. Para tanto, a avaliação das propriedades mecânicas da cartilagem tem a vantagem decisiva de descrever um parâmetro que se modifica durante o curso da OA, independentemente da etiologia da doença, e tem influência direta na funcionalidade tecidual em estágio muito precoce. Os instrumentos de indentação medem a força pela qual o tecido resiste à indentação. Este não é, de facto, um conceito novo; Os primeiros estudos datam das décadas de 1980 e 1990. Nesse período, numerosos estudos sugeriram que instrumentos de indentação projetados para as medidas artroscópicas da cartilagem articular poderiam ser bem adequados para detectar alterações degenerativas na cartilagem. Há 30 anos, alguns estudos conseguiram demonstrar que instrumentos de indentação eram capazes de detectar in vivo alterações na superfície da cartilagem durante a degeneração tecidual, realizando medidas de rigidez compressiva durante a artroscopia18,19,20.

A indentação de AFM (AFM-IT) da cartilagem articular fornece informações sobre uma propriedade mecânica fundamental do tecido, a rigidez. Trata-se de um parâmetro mecânico que descreve a relação entre uma carga aplicada não destrutiva e a deformação resultante da área de tecido recuada²¹. O AMO-TI mostrou-se capaz de quantificar modificações idade-dependentes na rigidez em redes de colágeno macroscopicamente não afetadas, diferenciando as alterações patológicas associadas ao aparecimento da OA (grau 0 na escala de Outerbridge na cartilagem articular)²². Nós mostramos anteriormente que AFM-ITs, com base na organização espacial dos condrócitos como um biomarcador baseado em imagem para a degeneração precoce da cartilagem, permitem não apenas quantificar, mas também identificar as alterações mecânicas degenerativas mais precoces. Esses achados já foram confirmados por outros^23,24. Assim, o AFM-IT atua como uma ferramenta interessante para diagnosticar e identificar alterações degenerativas precoces. Essas alterações já podem ser medidas em nível celular, remodelando a compreensão do processo fisiopatológico da OA.

Neste protocolo, demonstramos um completo procedimento de graduação histológica e biomecânica dos explantes da cartilagem articular, desde o preparo dos explantes da cartilagem nativa até a aquisição e processamento dos dados de MFA. Através de uma abordagem passo a passo, mostramos como gerar, graduar e classificar visualmente o tecido cartilaginoso articular de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens 2D de mosaico grande, seguidas de micro-AFM.

Embora atualmente o AFM-IT seja uma das ferramentas mais sensíveis para mensurar alterações biomecânicas na^cartilagem7, como qualquer outra técnica instrumental, apresenta limitações e peculiaridades^práticas25 que podem levar à aquisição errônea de dados. Para tanto, submetemos ao exame os problemas mais comuns que surgem durante as medidas de MFA dos explantes cartilaginosos e descrevemos, sempre que possível, como minimizá-los ou superá-los. Estes incluem aspectos topográficos das amostras e as dificuldades para estabilizá-las em um ambiente compatível com AFM, peculiaridades físicas da superfície do tecido e as dificuldades resultantes na realização de medidas de AFM nessas superfícies. Exemplos de curvas força-distância errôneas também são apresentados, enfatizando as condições que podem ocasioná-las. Limitações adicionais inerentes à geometria da ponta do cantilever e ao uso do modelo de Hertz para a análise dos dados também são discutidas.

Protocolo

Foram utilizados côndilos femorais coletados de pacientes submetidos à artroplastia total do joelho no Hospital Universitário de Tübingen, Alemanha. Apenas amostras de cartilagem articular de pacientes com patologias articulares degenerativas e pós-traumáticas foram incluídas neste estudo. Antes do início do estudo, foram obtidas aprovações departamentais, institucionais e de comitês de ética locais (Projeto nº 674/2016BO2). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da participação.

NOTA: Um fluxograma das etapas do experimento em sua ordem cronológica é dado na Figura 1.

1. Processamento tecidual e geração de discos cartilaginosos

1. Preparo de tecidos
   1. Após a ressecção pós-operatória, colocar as amostras de cartilagem em um recipiente preenchido com meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com penicilina-estreptomicina a 5% (v/v). Certifique-se de que as amostras estão completamente submersas no meio. A duração entre a ressecção cirúrgica e o processamento posterior da cartilagem não deve exceder 24 horas. Certifique-se de que, durante todo o processamento, as amostras estejam totalmente submersas em meios para evitar a secagem das amostras.
   2. Corte a cartilagem longe do osso usando um bisturi.
2. Geração de disco de cartilagem
   1. Gere discos de cartilagem de 4 mm de diâmetro usando um punch de biópsia.
      OBS: É importante selecionar e ressaltar as áreas do côndilo onde a espessura da camada cartilaginosa excede 1 mm. Isso pode ser problemático, especialmente ao redor de zonas de suporte de carga, onde a camada de cartilagem normalmente perde sua espessura devido a processos de desgaste ou degeneração.
   2. Coloque os discos de cartilagem de 4 mm gerados anteriormente em um dispositivo de corte feito sob medida e fixe e mantenha os discos de cartilagem estáveis por meio de uma espátula. Ao colocar os discos de cartilagem no dispositivo de corte, deve-se tomar cuidado. Posicione as amostras de modo que a camada mais superficial da cartilagem (a zona superficial da cartilagem articular) não fique voltada para a lâmina
   3. Corte os discos de cartilagem com uma lâmina de barbear. Amostras de cartilagem em forma de disco de 4 mm x 1 mm são, assim, geradas. Para evitar o ressecamento da amostra, realize o corte do tecido o mais rápido possível.
   4. Coletar cada disco com a ajuda de uma espátula e colocar os discos de cartilagem gerados em tubos de 1,5 mL contendo 1 mL de DMEM suplementado com 5% (v/v) de penicilina-estreptomicina. Coloque aproximadamente 15 discos em um tubo.
3. Secção criótomo dos discos de cartilagem (para cortes perpendiculares)
   NOTA: Esta etapa é opcional e pode ser empregada se uma visualização lateral da distribuição do padrão celular dentro dos discos de cartilagem for desejada. Pode ser utilizado como método de verificação, uma vez que a distribuição do padrão celular é uma característica 3D da cartilagem^articular26. Cortes ópticos e reconstruções 3D de todos os discos cartilaginosos com microscópio confocal também podem ser utilizados, afastando-se, assim, a necessidade de seccionar as amostras conforme descrito no protocolo.
   1. Cubra o disco de cartilagem com meio de incorporação solúvel em água e coloque-o em sua borda no botão do criótomo (com a superfície do disco perpendicular à superfície do botão). No dispositivo criótomo, o meio de incorporação congela a baixas temperaturas.
   2. Usando um criótomo padrão, seccione o tecido lateralmente a uma espessura de 60 μm até atingir o meio do disco (ou seja, quando as criossecções atingirem um comprimento de 4 mm) e colete os cortes. Seccionando-se o explante discal perpendicularmente, todas as zonas da cartilagem (superficial, média e profunda) podem ser visualizadas.
   3. Recolher as secções numa lâmina de vidro e remover o meio de incorporação solúvel em água lavando três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).

2. Triagem do disco cartilaginoso em função do padrão espacial celular

1. Coloração das amostras de cartilagem em forma de disco
   1. Colocar um disco de cartilagem (secção 1.2) em cada poço de uma placa de 96 poços e adicionar 130 μL de corante de fluorescência permeável às células numa diluição de 1:1.000 em cada poço.
   2. Inspecione visualmente toda a placa e certifique-se de que apenas um disco seja colocado em cada poço. Incubar a placa durante 30 minutos na incubadora de cultura celular padrão a 37 °C.
2. Coloração dos cortes de cartilagem de 60 μm
   1. Coloque suavemente as secções do disco de cartilagem (secção 1.3) em lâminas de microscópio de vidro com a ajuda de pinças.
   2. Cubra as seções de cartilagem com meio de montagem contendo contracoloração nuclear DAPI e coloque suavemente lamínulas adequadas para microscopia de fluorescência.
   3. Sele as bordas de cada lamínula com esmalte transparente regular e deixe secar por 3 min.
3. Classificação e imagem de cartilagem de cima para baixo e de visão lateral
   NOTA: Cada disco deve ser examinado sob um microscópio fluorescente. O objetivo desta etapa é classificar os discos com base em seu padrão celular predominante (cadeias simples, cordas duplas, pequenos agrupamentos, grandes aglomerados ou difusos).
   1. Coloque a placa de 96 poços no suporte da placa do microscópio de fluorescência.
   2. Seleccionar o filtro de fluorescência adequado de Em 495 nm/Ex 515 nm (para imagens descendentes dos discos de cartilagem preparadas no ponto 2.1.) ou Em 358 nm/Ex 461 nm (para imagens laterais dos cortes de cartilagem preparados no ponto 2.2) e a objetiva de 10x.
      NOTA: O uso da objetiva 10x permite que toda a circunferência do disco seja inspecionada, e amostras com coloração não homogênea ou inadequada podem ser excluídas. No entanto, o uso apenas da visão top-down pode resultar na percepção de mudanças na organização celular como resultado da análise das camadas teciduais mais profundas tornadas visíveis para observação de cima para baixo por erosão superficial. Como exemplo, uma corda ascendente seguindo as arcadas do colágeno poderia ser percebida como uma única célula ou células dispersas (padrão difuso)²⁶. Como resultado, ambos os lados dos discos devem ser inspecionados para garantir a seleção adequada do padrão celular.
   3. Determinar visualmente o padrão celular exibido em cada disco de cartilagem. É improvável que um disco tenha apenas um tipo de padrão celular. Para a parte do disco em que a disposição dos condrócitos não corresponde ao padrão de interesse, só aceite as amostras se o padrão indesejado estiver na periferia, onde não estão a ser efectuadas medições de AFM (ou seja, até 0,5 mm da borda do disco), e certifique-se de que esta não exceda 10% da superfície total do disco^{27, 28º}.
4. Aquisição de imagens de todos os discos de cartilagem
   1. Selecionar a objetiva de 10x do microscópio e posicioná-la abaixo do poço pré-selecionado contendo um disco de cartilagem individual. Concentre-se no disco para ver o padrão celular.
   2. Selecione a função Navegador para obter uma visão geral de todo o poço. Use o botão esquerdo do mouse e arraste para navegar até uma posição de palco diferente. Com a roda do mouse, aumente e diminua o zoom.
      NOTA: Neste ponto, uma visualização do poço com toda a amostra pode ser vista clicando duas vezes em cada área de interesse sequencialmente.
   3. Selecione um quadrado que englobe a área de interesse a ser digitalizada; Neste ponto, todos os azulejos individuais que compõem o mosaico se tornarão visíveis.
   4. Ajuste a exposição/intensidade da luz para que as células possam ser claramente visualizadas a partir do fundo. Neste ponto, o brilho/contraste da imagem foi ajustado para todos os blocos e não pode mais ser personalizado individualmente para cada bloco.
      NOTA: Como as células próximas à borda do disco geralmente emitem um sinal de fluorescência mais alto do que as células no centro, as configurações de exposição/intensidade de luz devem ser adaptadas.
      1. Para avaliar se o tempo de exposição é apropriado para um determinado canal, examine a distribuição do sinal no histograma. Usando o mecanismo de exposição automática incluído no software de imagem do microscópio, visualize todas as células que residem dentro do disco.
   5. Selecione a opção Ponto de Mapa de Foco do software e, em seguida, selecione cada bloco individual clicando com o botão esquerdo do mouse no centro dele.
   6. Selecione a opção Mapa de Foco. Uma janela é exibida com todos os blocos selecionados anteriormente. Clique duas vezes em um bloco na lista para exibi-lo e colocá-lo em foco adequado.
   7. Clique em Definir Z para salvar o plano focal e prosseguir para o próximo bloco. Depois de ajustar o plano focal para cada bloco individual, comece a aquisição de imagens pressionando Start Scan.
      1. Se a varredura estiver exibindo barras horizontais e/ou verticais mais escuras, isso pode ser devido à iluminação inadequada e irregular dos quadros individuais. Resolva isso usando a opção Sombreamento vinculado incorporada ao software antes da verificação real.
   8. Salve, exporte e anote corretamente as imagens.

3. Abordagem biomecânica dos explantes cartilaginosos

1. Preparação de amostras para medições de AFM
   1. Fixar cada disco de cartilagem pré-selecionado contendo um padrão celular (secção 2) em placas de Petri através de cola biocompatível. Adicione cola de amostra suficiente nos lados superior, inferior, esquerdo e direito do disco.
   2. Cobrir os discos com 2,5 mL de meio L-15 de Leibovitz sem L-glutamina. Adicionar o meio de Leibowitz suavemente sobre as amostras para evitar o desprendimento da amostra da superfície devido às ondas criadas pelo meio.
2. Carregamento das amostras no AFM
   1. Posicione a placa de Petri no porta-amostras do dispositivo AFM e ligue o aquecedor de placa de Petri regulado para 37 °C. Permitir que a placa de cultura de tecidos atinja a temperatura desejada. Isso é feito para excluir possíveis artefatos causados pela variação de temperatura.
3. Calibração AFM-cantilever
   1. Inicialize a configuração do software conforme descrito anteriormente por Danalache et ^al.29.
   2. Selecione um suporte de cantilever de bloco de vidro adequado para medições de líquidos e coloque-o cuidadosamente na cabeça do AFM. Um mecanismo de travamento prende o bloco de vidro na cabeça do AFM. Certifique-se de que a superfície refletiva do bloco de vidro esteja reta e paralela ao suporte AFM.
   3. Coloque o cantilever na superfície do suporte de cantilever de bloco de vidro com cuidado. O próprio cantilever deve repousar no plano óptico polido, no centro do bloco de vidro.
   4. Coloque cuidadosamente uma saia de silicone (membrana de silicone) na base do suporte do cantiléver, a fim de evitar a condensação média na cabeça do AFM.
   5. Abaixe o cantilever em passos de 100 μm usando a função do motor de passo até que ele esteja completamente submerso no meio.
   6. Execute uma abordagem de scanner com os parâmetros de abordagem descritos por Danalache et ^al.29. Retraia o cantilever em 100 μm assim que o fundo da placa de Petri for atingido.
   7. Calibrar o cantilever usando os passos exatos e executar os parâmetros descritos por Danalache et ^al.29. Ao final da calibração, a deflexão vertical é salva e exibida em unidades de força newton (N) em vez de volts (V) - a unidade do registro original pelo detector de fotodiodo. Nos experimentos aqui apresentados, um set point de 4,47 nN resultou após a calibração.
   8. Usando a função do motor de passo, retraia o cantilever para 1.000 μm.
4. Identificação do local de mensuração da cartilagem desejada sob o AFM
   NOTA: Devido à espessura de 1 mm dos discos de cartilagem, o cantilever não é visível no campo de visão durante a navegação sobre a amostra.
   1. Use a câmera CCD do microscópio para identificar o cantilever. O cantilever AFM deve ser posicionado em uma área livre de amostras da placa de Petri.
   2. Inicie uma abordagem de scanner com o cantilever em uma área limpa e livre de amostras da placa de Petri, usando os mesmos parâmetros descritos por Danalache et ^al.29.
   3. Retraia ainda mais o cantilever a 1,5 mm de distância do fundo da placa com o controle do motor de passo. Esta etapa é crucial para evitar uma colisão direta entre o cantilever e a amostra.
   4. Alterne da visualização de campo brilhante para a visualização de fluorescência e identifique visualmente a parte superior do disco.
   5. Mova o suporte de amostra AFM exatamente 2 mm em direção ao meio do disco. Este ponto é considerado o centro do disco cartilaginoso.
   6. Execute uma abordagem de scanner e, uma vez atingida a superfície do disco de cartilagem, retraia o cantilever em 100 μm.
5. Medidas da curva força-distância
   1. Concentre-se nas células posicionadas no local de medição desejado. Clique no botão Executar para iniciar as medições e a geração de curvas de força-distância na posição de destino.
   2. Adquira cinco curvas força-distância em cada local de medição. Retrair o cantilever em 500 μm e mover o cantilever para o próximo local de medição.
      OBS: A retração do cantilever é um passo crucial, pois a superfície do disco cartilaginoso não é homogênea e apresenta irregularidades. Uma colina alta na superfície da amostra pode resultar em uma colisão dramática, levando a danos indesejados na ponta/amostra do cantiléver. Recomendamos selecionar um mínimo de cinco locais de medição diferentes dispersos pela superfície do disco e adquirir um mínimo de cinco curvas força-distância em cada local.
   3. Inspecione as curvas força-distância e salve-as.
6. Estimação dos módulos de Young pelo modelo de ajuste de Hertz
   1. Abra as curvas de força-distância geradas a serem analisadas (arquivo .jpk) no software de análise de dados usando a opção Abrir um lote de curvas de espectroscopia .
   2. Selecione o modelo de ajuste Hertz e, em seguida, selecione a opção Ajuste de elasticidade .
      1. A opção de ajuste de elasticidade executa automaticamente os seguintes cálculos na curva de força-distância selecionada: calcula a linha de base e subtrai toda a curva para remover o deslocamento da linha de base (a linha de base é trazida de volta a zero no eixo y); determina o ponto de contacto detectando o ponto onde a curva força-distância cruza a linha de força zero (o ponto de contacto é definido como zero no eixo x); calcula a separação ponta-amostra (o sinal de altura do piezo que representa a flexão do cantilever é subtraído); e ajusta a curva força-distância automaticamente com o modelo selecionado. Se desejar, cada uma dessas etapas também pode ser realizada de forma independente.
   3. Adapte usando os seguintes parâmetros de ajuste: razão de Poisson de 0,5 e o raio apropriado da ponta do cantiléver.
      NOTA: Ao usar um cantilever com uma ponta de cantilever esférico, o modelo de ajuste Hertz deve ser usado. O cantilever utilizado neste estudo possuía ponta esférica com raio de 5 μm. Recomendamos o ajuste da curva força-distância até atingir a força máxima aplicada (setpoint).
   4. Verifique visualmente o ajuste da curva força-distância para garantir a correção. Essa etapa deve ser feita para cada uma das curvas força-distância analisadas.
7. Determinação da profundidade de recuo
   Observação : dependendo da ferramenta de análise de dados que está sendo usada, esse processo pode ser diferente. O experimentador pode facilmente ler a profundidade de recuo seguindo uma série de etapas incluídas no programa de análise de dados.
   1. Abra cada uma das curvas de força-distância geradas no software de análise de dados e selecione o Modelo de ajuste de Hertz como processo de análise.
   2. Aplique a opção Subtrair Deslocamento da Linha de Base para zerar o eixo de deflexão vertical (eixo y) e selecione a função Deslocamento + Inclinação .
   3. Use a função Localizar ponto de contato para identificar automaticamente o ponto de contato , que é automaticamente levado a uma coordenada x de zero.
   4. Subtraia a distância que representa apenas a deflexão do cantilever da altura bruta do piezo durante o recuo usando a função Posição da Ponta Vertical .
   5. Selecione a opção Ajuste de elasticidade para exibir a curva de força-distância processada e selecione a área do gráfico para que ele se alinhe com o valor mais negativo no Eixo de Posição da Ponta Vertical (eixo x).
   6. Leia e documente o recuo da caixa X Min na guia parâmetro. Salve e documente os resultados.

4. Análise estatística

1. Abra o software estatístico. Selecione Novo Conjunto de Dados no menu suspenso.
2. Abra a guia Exibição de variável depois de selecionar o arquivo DataSet . Defina as variáveis numéricas para cada categoria de padrão celular: cadeias simples = SS, cadeias duplas = DS, pequenos clusters = SC, grandes clusters = BC, difusos e os módulos de Young.
3. Na guia de exibição de dados, insira os dados de módulos de Young medidos para cada uma das categorias de padrão celular correspondentes. Analise a distribuição de dados selecionando Analisar na barra de menus e, em seguida, Análise Exploratória de Dados.
4. Selecione Módulos de Young como variável dependente e Padrão Celular como a lista de fatores. Um gráfico de caixa usado para a seção de resultados é exibido entre os resultados no arquivo de saída.
5. Para realizar uma análise estatística, escolha Amostras dependentes na seção de teste não paramétrico da guia da barra de menus de análise. Selecione Módulos de Young como Campos de Teste e Padrão Celular como Grupos na guia Campos.
   Observação : os resultados são exibidos no arquivo de saída. Para a análise estatística, é realizado o teste de Friedman.
6. Incorpore os valores de p do teste não paramétrico no gráfico de caixa criado na etapa 4.4. Salve os resultados clicando em Arquivo na barra de menus e selecionando Salvar.

Resultados

Usando um dispositivo de corte de fabricação própria, foi possível explantar e gerar discos de cartilagem pequenos (4 mm x 1 mm) a partir de côndilos humanos frescos contendo um padrão espacial celular único³⁰ de cordas simples (SS, Figura 2A), cordas duplas (DS), pequenos aglomerados (SC), grandes aglomerados (BC; Figura 2A) e difusa (Figura 2B). Um explante representativo da cartilagem está represen...

Discussão

Como doença progressiva e multifatorial, a OA desencadeia alterações estruturais e funcionais da cartilagem articular. Ao longo do curso da OA, o comprometimento das características mecânicas é acompanhado por alterações estruturais e bioquímicas na superfície da cartilagem articular ^27,31. Os eventos patológicos mais precoces que ocorrem na OA são a depleção de proteoglicanos associada à ruptura da rede de colágeno^32,33,34...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium