Affrontare i problemi pratici nella microindentazione basata sulla microscopia a forza atomica su espianti di cartilagine articolare umana

Riepilogo

Presentiamo un approccio passo-passo per identificare e affrontare i problemi più comuni associati alle micro-indentazioni di microscopia a forza atomica. Esemplificamo i problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare umana nativa caratterizzati da vari gradi di degenerazione guidata dall'osteoartrite.

Abstract

Senza dubbio, la microscopia a forza atomica (AFM) è attualmente una delle tecniche più potenti e utili per valutare micro e persino nano-segnali in campo biologico. Tuttavia, come con qualsiasi altro approccio microscopico, possono sorgere sfide metodologiche. In particolare, le caratteristiche del campione, la preparazione del campione, il tipo di strumento e la sonda di indentazione possono portare ad artefatti indesiderati. In questo protocollo, esemplificamo questi problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare sana e osteoartritica. A tal fine, mostriamo innanzitutto attraverso un approccio passo-passo come generare, classificare e classificare visivamente i dischi di cartilagine articolare ex vivo in base ai diversi stadi di degenerazione per mezzo di un grande imaging a fluorescenza a mosaico 2D dell'intero tessuto espianto. Il principale punto di forza del modello ex vivo è che comprende cartilagine umana invecchiata, nativa, che consente di studiare i cambiamenti correlati all'osteoartrite dall'esordio precoce alla progressione. Inoltre, vengono presentate anche le insidie comuni nella preparazione dei tessuti, nonché l'effettiva procedura AFM insieme alla successiva analisi dei dati. Mostriamo come le fasi di base ma cruciali come la preparazione e l'elaborazione del campione, le caratteristiche topografiche del campione causate dalla degenerazione avanzata e l'interazione campione-punta possano influire sull'acquisizione dei dati. Sottoponiamo inoltre ad esame i problemi più comuni nell'AFM e descriviamo, ove possibile, come superarli. La conoscenza di questi limiti è della massima importanza per la corretta acquisizione dei dati, l'interpretazione e, in ultima analisi, l'integrazione dei risultati in un ampio contesto scientifico.

Introduzione

A causa delle dimensioni sempre più ridotte dei dispositivi e dei sistemi elettronici, il rapido sviluppo di tecnologie e apparecchiature a base di micro e nano ha guadagnato slancio. Uno di questi dispositivi è la microscopia a forza atomica (AFM), che può scansionare superfici biologiche e recuperare informazioni topografiche o biomeccaniche su scala nanometrica^e micrometrica ^1,2. Tra le sue vaste caratteristiche, questo strumento può essere utilizzato sia come micro che come nano-penetratore per ottenere informazioni sulle proprietà meccaniche di vari sistemi biologici 3,4,5,6. I dati vengono raccolti per contatto fisico con la superficie attraverso una sonda meccanica, che può essere piccola fino a circa 1 nm alla sua punta⁷. La deformazione risultante del campione viene quindi visualizzata in base alla profondità di indentazione della punta a sbalzo e alla forza applicata sul campione⁸.

L'osteoartrite (OA) è una malattia cronica degenerativa a lungo termine caratterizzata dal deterioramento della cartilagine articolare delle articolazioni e dei tessuti circostanti, che può portare alla completa esposizione delle superfici ossee. L'onere dell'OA è notevole; attualmente, la metà di tutte le donne e un terzo di tutti gli uomini di età pari o superiore a 65 anni soffrono di OA⁹. I traumi, l'obesità e la conseguente alterazione della biomeccanica dell'articolazione¹⁰ determinano la degenerazione della cartilagine articolare, che viene vista come un risultato finale comune. Lo studio pionieristico di Ganz et al. ha postulato che le prime fasi del processo OA possono coinvolgere le proprietà biomeccaniche della cartilagine¹¹, e da allora i ricercatori hanno confermato questa ipotesi¹². Allo stesso modo, è generalmente accettato che le proprietà biomeccaniche del tessuto siano funzionalmente orchestrate dall'organizzazione ultrastrutturale e dal crosstalk cellula-cellula e cellula-matrice. Qualsiasi alterazione può avere un impatto drammatico sul funzionamento biomeccanico complessivo del tessuto¹³. Ad oggi, la diagnosi di OA è clinica e si basa sulla radiografia a film semplice¹⁴. Questo approccio è duplice: in primo luogo, la mancanza di una soglia di cut-off degenerativa definita per formulare la diagnosi di OA rende la condizione difficile da quantificare e, in secondo luogo, i metodi di imaging mancano di sensibilità e standardizzazione e non possono rilevare danni localizzati alla cartilagine^15,16,17. A tal fine, la valutazione delle proprietà meccaniche della cartilagine ha il vantaggio decisivo di descrivere un parametro che cambia durante il decorso dell'OA indipendentemente dall'eziologia della malattia e ha un'influenza diretta sulla funzionalità tissutale in una fase molto precoce. Gli strumenti di indentazione misurano la forza con cui il tessuto resiste all'indentazione. Non si tratta, infatti, di un concetto nuovo; I primi studi risalgono agli anni '80 e '90. In questo periodo, numerosi studi hanno suggerito che gli strumenti di indentazione progettati per le misurazioni artroscopiche della cartilagine articolare potrebbero essere adatti per rilevare cambiamenti degenerativi nella cartilagine. Anche 30 anni fa, alcuni studi sono stati in grado di dimostrare che gli strumenti di indentazione erano in grado di rilevare in vivo i cambiamenti nella superficie della cartilagine durante la degenerazione tissutale conducendo misurazioni della rigidità a compressione durante l'artroscopia^18,19,20.

L'indentazione AFM (AFM-IT) della cartilagine articolare fornisce informazioni su una proprietà meccanica fondamentale del tessuto, vale a dire la rigidità. Si tratta di un parametro meccanico che descrive la relazione tra un carico non distruttivo applicato e la deformazione risultante dell'area del tessuto dentellata²¹. AFM-IT ha dimostrato di essere in grado di quantificare le modificazioni dipendenti dall'età nella rigidità nelle reti di collagene macroscopicamente non interessate, differenziando così tra i cambiamenti patologici associati all'insorgenza dell'OA (grado 0 sulla scala Outerbridge nella cartilagine articolare)²². In precedenza abbiamo dimostrato che gli AFM-IT, sulla base dell'organizzazione spaziale dei condrociti come biomarcatore basato su immagini per la degenerazione precoce della cartilagine, consentono non solo di quantificare ma anche di individuare effettivamente i primi cambiamenti meccanici degenerativi. Questi risultati sono già stati confermati da altri^23,24. Quindi, AFM-IT agisce come uno strumento interessante per diagnosticare e identificare i cambiamenti degenerativi precoci. Questi cambiamenti possono essere già misurati a livello cellulare, rimodellando la comprensione del processo fisiopatologico dell'OA.

In questo protocollo, dimostriamo una procedura completa di grading istologico e biomeccanico degli espianti di cartilagine articolare, dalla preparazione dell'espianto di cartilagine nativa all'acquisizione e all'elaborazione dei dati AFM. Attraverso un approccio passo-passo, mostriamo come generare, classificare e classificare visivamente il tessuto cartilagineo articolare in base alle diverse fasi di degenerazione per mezzo di imaging a mosaico di grandi dimensioni 2D, seguito da rientranze micro-AFM.

Anche se, attualmente, l'AFM-IT è uno degli strumenti più sensibili per misurare le alterazioni biomeccaniche della cartilagine⁷, come ogni altra tecnica strumentale, presenta limitazioni e peculiarità pratiche²⁵ che possono portare ad un'errata acquisizione dei dati. A tal fine, sottoponiamo ad esame i problemi più comuni che sorgono durante le misurazioni AFM degli espianti di cartilagine e descriviamo, ove possibile, come minimizzarli o superarli. Questi includono gli aspetti topografici dei campioni e le difficoltà di stabilizzarli in un ambiente compatibile con l'AFM, le peculiarità fisiche della superficie del tessuto e le conseguenti difficoltà nell'eseguire misurazioni AFM su tali superfici. Vengono anche presentati esempi di curve forza-distanza errate, sottolineando le condizioni che possono causarle. Vengono inoltre discusse ulteriori limitazioni inerenti alla geometria della punta a sbalzo e all'uso del modello Hertz per l'analisi dei dati.

Protocollo

Sono stati utilizzati condili femorali prelevati da pazienti sottoposti ad artroplastica totale del ginocchio presso l'ospedale universitario di Tubinga, in Germania. In questo studio sono stati inclusi solo campioni di cartilagine articolare di pazienti con patologie articolari degenerative e post-traumatiche. Prima dell'inizio dello studio è stata ottenuta l'approvazione del comitato etico dipartimentale, istituzionale e locale (Progetto n.674/2016BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della partecipazione.

NOTA: Nella Figura 1 è riportato un diagramma di flusso delle fasi dell'esperimento in ordine cronologico.

1. Elaborazione dei tessuti e generazione di dischi cartilaginei

1. Preparazione dei tessuti
   1. Dopo la resezione post-operatoria, posizionare i campioni di cartilagine in un contenitore riempito con il terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 5% (v/v) di penicillina-streptomicina. Assicurarsi che i campioni siano completamente immersi nel terreno. La durata tra la resezione chirurgica e l'ulteriore lavorazione della cartilagine non deve superare le 24 ore. Assicurarsi che, durante l'intera lavorazione, i campioni siano completamente immersi nel terreno per evitare l'essiccazione del campione.
   2. Tagliare la cartilagine dall'osso usando un bisturi.
2. Generazione del disco cartilagineo
   1. Generare dischi cartilaginei di 4 mm di diametro utilizzando un punzone per biopsia.
      NOTA: È importante selezionare e resecare le aree del condilo in cui lo spessore dello strato di cartilagine supera 1 mm. Questo potrebbe essere problematico, soprattutto intorno alle zone portanti, dove lo strato di cartilagine in genere perde il suo spessore a causa di processi di usura o degenerazione.
   2. Posizionare i dischi di cartilagine da 4 mm precedentemente generati su un dispositivo di taglio su misura e fissare e tenere stabili i dischi di cartilagine per mezzo di una spatola. Quando si posizionano i dischi di cartilagine sul dispositivo di taglio, è necessario prestare attenzione. Posizionare i campioni in modo che lo strato superiore della cartilagine (la zona superficiale della cartilagine articolare) non sia rivolto verso la lama
   3. Tagliare i dischi di cartilagine con una lama di rasoio. Vengono quindi generati campioni di cartilagine a forma di disco di 4 mm x 1 mm. Per evitare l'essiccazione del campione, eseguire il taglio dei tessuti il più rapidamente possibile.
   4. Raccogliere ogni disco con l'aiuto di una spatola e posizionare i dischi di cartilagine generati in provette da 1,5 mL contenenti 1 mL di DMEM integrato con il 5% (v/v) di penicillina-streptomicina. Mettere circa 15 dischi in una provetta.
3. Sezionamento criotomo dei dischi cartilaginei (per fette perpendicolari)
   NOTA: Questo passaggio è facoltativo e può essere utilizzato se si desidera una visualizzazione laterale della distribuzione del pattern cellulare all'interno dei dischi cartilaginei. Può essere utilizzato come metodo di verifica in quanto la distribuzione del pattern cellulare è una caratteristica 3D della cartilagine articolare²⁶. Possono essere utilizzati anche il sezionamento ottico e le ricostruzioni 3D dell'intero disco cartilagineo mediante microscopio confocale, eliminando così la necessità di sezionare i campioni come descritto nel protocollo.
   1. Coprire il disco cartilagineo con un mezzo di inclusione solubile in acqua e posizionarlo sul bordo della manopola del criotomo (con la superficie del disco perpendicolare alla superficie della manopola). Nel dispositivo criotomo, il mezzo di inclusione si congela a basse temperature.
   2. Utilizzando un criotomo standard, sezionare il tessuto lateralmente a uno spessore di 60 μm fino a raggiungere la metà del disco (cioè quando le criosezioni raggiungono una lunghezza di 4 mm) e raccogliere le fette. Sezionando l'espianto del disco perpendicolarmente, è possibile visualizzare tutte le zone della cartilagine (superficiale, media e profonda).
   3. Raccogliere le sezioni su un vetrino e rimuovere il mezzo di inclusione solubile in acqua lavando tre volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS).

2. Ordinamento del disco cartilagineo in funzione del pattern spaziale cellulare

1. Colorazione dei campioni di cartilagine a forma di disco
   1. Posizionare un disco di cartilagine (sezione 1.2) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 130 μL di colorante fluorescente permeabile alle cellule a una diluizione di 1:1.000 in ciascun pozzetto.
   2. Ispezionare visivamente l'intera piastra e assicurarsi che in ciascun pozzetto sia posizionato un solo disco. Incubare la piastra per 30 minuti nell'incubatore standard per colture cellulari a 37 °C.
2. Colorazione delle fette di cartilagine da 60 μm
   1. Posizionare delicatamente le sezioni del disco cartilagineo (sezione 1.3) su vetrini da microscopio con l'aiuto di una pinza.
   2. Coprire le sezioni della cartilagine con un mezzo di montaggio contenente controcolorazione DAPI nucleare e posizionare delicatamente i vetrini coprioggetti adatti alla microscopia a fluorescenza.
   3. Sigillare i bordi di ogni vetrino coprioggetto con un normale smalto trasparente e lasciare asciugare per 3 minuti.
3. Smistamento e imaging della cartilagine dall'alto verso il basso e laterale
   NOTA: Ogni disco deve essere esaminato al microscopio a fluorescenza. Lo scopo di questo passaggio è quello di ordinare i dischi in base al loro pattern cellulare predominante (stringhe singole, stringhe doppie, piccoli cluster, grandi cluster o diffusi).
   1. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto della piastra del microscopio a fluorescenza.
   2. Selezionare il filtro a fluorescenza appropriato di Em 495 nm/Ex 515 nm (per l'imaging dall'alto verso il basso dei dischi cartilaginei preparato nel paragrafo 2.1.) o Em 358 nm/Ex 461 nm (per l'imaging laterale delle sezioni di cartilagine preparato nel paragrafo 2.2) e l'obiettivo 10x.
      NOTA: L'uso dell'obiettivo 10x consente di ispezionare l'intera circonferenza del disco e di escludere campioni con colorazioni disomogenee o improprie. Tuttavia, l'utilizzo della sola vista dall'alto verso il basso può comportare la percezione di cambiamenti nell'organizzazione cellulare come risultato dell'analisi degli strati di tessuto più profondi resi visibili all'osservazione dall'alto verso il basso dall'erosione superficiale. Ad esempio, una corda ascendente che segue le arcate del collagene potrebbe essere percepita come una singola cellula o cellule sparse (modello diffuso)²⁶. Di conseguenza, entrambi i lati dei dischi devono essere ispezionati per garantire una corretta selezione del modello cellulare.
   3. Determinare visivamente il modello cellulare visualizzato in ciascun disco cartilagineo. È improbabile che un disco abbia un solo tipo di pattern cellulare. Per la porzione del disco in cui la disposizione dei condrociti non corrisponde al modello di interesse, accettare i campioni solo se il modello indesiderato si trova alla periferia, dove non vengono effettuate misurazioni AFM (cioè fino a 0,5 mm dal bordo del disco) e assicurarsi che questo non superi il 10% della superficie totale del disco^{27, 28}.
4. Acquisizione di immagini dell'intero disco cartilagineo
   1. Selezionare l'obiettivo 10x del microscopio e posizionarlo sotto il pozzetto preselezionato contenente un singolo disco di cartilagine. Concentrati sul disco per vedere il modello cellulare.
   2. Selezionare la funzione Navigatore per avere una panoramica dell'intero pozzo. Utilizzate il pulsante sinistro del mouse e trascinate per spostarvi in un'altra posizione dello stage. Con la rotellina del mouse, ingrandisci e rimpicciolisci.
      NOTA: A questo punto, è possibile visualizzare un'anteprima del pozzetto con l'intero campione facendo doppio clic su ciascuna area di interesse in sequenza.
   3. Selezionare un quadrato che racchiuda l'area di interesse da scansionare; A questo punto diventeranno visibili tutte le singole tessere che compongono il mosaico.
   4. Regola l'esposizione/intensità della luce in modo che le celle possano essere visualizzate chiaramente dallo sfondo. A questo punto, la luminosità/contrasto dell'immagine è stata regolata per tutte le tessere e non può più essere personalizzata singolarmente per ogni riquadro.
      NOTA: Poiché le celle vicine al bordo del disco spesso emettono un segnale di fluorescenza più elevato rispetto alle celle al centro, le impostazioni di esposizione/intensità della luce devono essere adattate.
      1. Per valutare se il tempo di esposizione è appropriato per un particolare canale, esaminare la distribuzione del segnale nell'istogramma. Utilizzando il meccanismo di esposizione automatica incluso nel software di imaging del microscopio, è possibile visualizzare tutte le cellule che risiedono all'interno del disco.
   5. Seleziona l'opzione Punto mappa di messa a fuoco del software, quindi seleziona ogni singola tessera facendo clic con il pulsante sinistro del mouse al centro di essa.
   6. Selezionare l'opzione Mappa messa a fuoco. Viene visualizzata una finestra con tutti i riquadri selezionati in precedenza. Fare doppio clic su un riquadro nell'elenco per visualizzarlo e metterlo a fuoco.
   7. Fare clic su Imposta Z per salvare il piano focale e passare al riquadro successivo. Dopo aver regolato il piano focale per ogni singolo riquadro, iniziare l'acquisizione dell'immagine premendo Avvia scansione.
      1. Se la scansione visualizza barre orizzontali e/o verticali più scure, ciò potrebbe essere dovuto a un'illuminazione impropria e irregolare dei singoli fotogrammi. Per risolvere questo problema, utilizzare l'opzione Linked Shading incorporata nel software prima della scansione effettiva.
   8. Salvare, esportare e annotare correttamente le immagini.

3. Approccio biomeccanico degli espianti di cartilagine

1. Preparazione del campione per le misurazioni AFM
   1. Fissare ogni disco di cartilagine preselezionato contenente un pattern cellulare (sezione 2) in piastre di Petri per mezzo di colla biocompatibile. Aggiungere una quantità sufficiente di colla campione sui lati superiore, inferiore, sinistro e destro del disco.
   2. Coprire i dischi con 2,5 ml di terreno L-15 di Leibovitz senza L-glutammina. Aggiungere delicatamente il terreno di Leibowitz sui campioni per evitare il distacco del campione dalla superficie a causa delle onde create dal terreno.
2. Caricamento dei campioni nell'AFM
   1. Posizionare la capsula di Petri nel portacampioni del dispositivo AFM e accendere il riscaldatore della piastra di Petri impostato a 37 °C. Lasciare che la piastra di coltura tissutale raggiunga la temperatura desiderata. Questo viene fatto per escludere possibili artefatti causati dalla variazione di temperatura.
3. Calibrazione a sbalzo AFM
   1. Inizializzare la configurazione del software come descritto in precedenza da Danalache et ^al.29.
   2. Selezionare un supporto a sbalzo per mattoni di vetro adatto per le misurazioni dei liquidi e posizionarlo con cura sulla testa AFM. Un meccanismo di bloccaggio fissa il mattone di vetro nella testa AFM. Assicurarsi che la superficie riflettente del mattone di vetro sia diritta e parallela al supporto AFM.
   3. Posizionare con cura il cantilever sulla superficie del supporto a sbalzo in mattone di vetro. Il cantilever stesso dovrebbe poggiare sul piano ottico lucido, al centro del mattone di vetro.
   4. Posizionare con cautela una gonna in silicone (membrana in silicone) sulla base del supporto a sbalzo per evitare la condensa media nella testa AFM.
   5. Abbassare il cantilever a passi di 100 μm utilizzando la funzione del motore passo-passo fino a quando non è completamente immerso nel fluido.
   6. Eseguire un approccio scanner con i parametri di avvicinamento descritti da Danalache et ^al.29. Ritrarre il cantilever di 100 μm una volta raggiunto il fondo della piastra di Petri.
   7. Calibrare il cantilever utilizzando i passaggi esatti ed eseguire i parametri descritti da Danalache et ^al.29. Al termine della calibrazione, la deflessione verticale viene salvata e visualizzata in newton (N) unità di forza anziché in volt (V), l'unità di registrazione originale dal rivelatore a fotodiodo. Negli esperimenti qui riportati, dopo la calibrazione è risultato un set point di 4,47 nN.
   8. Utilizzando la funzione del motore passo-passo, ritrarre il cantilever a 1.000 μm.
4. Identificazione del sito di misurazione della cartilagine desiderato nell'ambito dell'AFM
   NOTA: A causa dello spessore di 1 mm dei dischi cartilaginei, il cantilever non è visibile nel campo visivo durante la navigazione sul campione.
   1. Utilizzare la telecamera CCD del microscopio per identificare il cantilever. Il cantilever AFM deve essere posizionato in un'area priva di campioni della piastra di Petri.
   2. Avviare un approccio scanner con il cantilever su un'area pulita e priva di campioni della capsula di Petri, utilizzando gli stessi parametri descritti da Danalache et ^al.29.
   3. Ritrarre ulteriormente il cantilever a 1.5 mm di distanza dalla parte inferiore della piastra con il comando del motore passo-passo. Questo passaggio è fondamentale per evitare una collisione diretta tra il cantilever e il campione.
   4. Passa dalla visualizzazione in campo chiaro a quella a fluorescenza e identifica visivamente la parte superiore del disco.
   5. Spostare il supporto del campione AFM esattamente di 2 mm verso il centro del disco. Questo punto è considerato il centro del disco cartilagineo.
   6. Eseguire un approccio scanner e, una volta raggiunta la superficie del disco cartilagineo, ritrarre il cantilever di 100 μm.
5. Misure della curva forza-distanza
   1. Particolare delle celle posizionate nel sito di misurazione desiderato. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare le misurazioni e la generazione di curve forza-distanza nella posizione desiderata.
   2. Acquisisci cinque curve forza-distanza su ciascun sito di misurazione. Ritrarre il cantilever di 500 μm e spostarlo nel punto di misurazione successivo.
      NOTA: La retrazione del cantilever è un passaggio cruciale, poiché la superficie del disco cartilagineo non è omogenea e presenta irregolarità. Una collinetta alta sulla superficie del campione può provocare una collisione drammatica, con conseguenti danni indesiderati alla punta a sbalzo/al campione. Si consiglia di selezionare un minimo di cinque diversi siti di misurazione sparsi sulla superficie del disco e di acquisire un minimo di cinque curve forza-distanza in ciascun sito.
   3. Ispezionate le curve forza-distanza e salvatele.
6. Stima dei moduli di Young utilizzando il modello di adattamento di Hertz
   1. Aprire le curve forza-distanza generate da analizzare (file .jpk) nel software di analisi dei dati utilizzando l'opzione Apri un batch di curve di spettroscopia .
   2. Selezionare il modello di adattamento Hertz , quindi selezionare l'opzione Adattamento elasticità .
      1. L'opzione di adattamento dell'elasticità esegue automaticamente i seguenti calcoli sulla curva forza-distanza selezionata: calcola la linea di base e sottrae dall'intera curva per rimuovere l'offset della linea di base (la linea di base viene riportata a zero sull'asse y); determina il punto di contatto rilevando il punto in cui la curva forza-distanza interseca la linea di forza zero (il punto di contatto è impostato a zero sull'asse x); calcola la separazione punta-campione (viene sottratto il segnale di altezza del piezoelettrico che tiene conto della flessione del cantilever); e adatta automaticamente la curva forza-distanza al modello selezionato. Se lo si desidera, ognuno di questi passaggi può essere eseguito anche in modo indipendente.
   3. Adattare utilizzando i seguenti parametri di adattamento: rapporto di Poisson di 0,5 e il raggio di punta a sbalzo appropriato.
      NOTA: Quando si utilizza una trave a sbalzo con una punta a sbalzo sferica, è necessario utilizzare il modello Hertz fit. Il cantilever utilizzato in questo studio aveva una punta sferica con un raggio di 5 μm. Si consiglia di adattare la curva forza-distanza fino al raggiungimento della forza massima applicata (setpoint).
   4. Controllare visivamente l'adattamento della curva forza-distanza per garantirne la correttezza. Questo passaggio deve essere eseguito per ciascuna delle curve forza-distanza analizzate.
7. Determinazione della profondità di indentazione
   NOTA: A seconda dello strumento di analisi dei dati utilizzato, questo processo può variare. Lo sperimentatore può facilmente leggere la profondità di indentazione seguendo una serie di passaggi inclusi nel programma di analisi dei dati.
   1. Aprire ciascuna delle curve forza-distanza generate nel software di analisi dei dati e selezionare il modello di adattamento di Hertz come processo di analisi.
   2. Applicare l'opzione Sottrai offset linea di base per azzerare l'asse di deflessione verticale (asse y) e selezionare la funzione Offset + Tilt .
   3. Utilizzare la funzione Trova punto di contatto per identificare automaticamente il punto di contatto , che viene automaticamente portato a una coordinata x pari a zero.
   4. Sottrarre la distanza tenendo conto esclusivamente della deflessione a sbalzo dall'altezza piezoelettrica grezza durante l'indentazione utilizzando la funzione Posizione punta verticale .
   5. Selezionare l'opzione Adattamento elasticità per visualizzare la curva forza-distanza elaborata e selezionare l'area del grafico in modo che sia allineata con il valore più negativo sull'asse di posizione verticale della punta (asse x).
   6. Leggere e documentare l'indentazione dalla casella X Min nella scheda dei parametri. Salvare e documentare i risultati.

4. Analisi statistica

1. Aprire il software statistico. Selezionare Nuovo set di dati dal menu a discesa.
2. Aprire la scheda Visualizzazione variabile dopo aver selezionato il file DataSet . Definire le variabili numeriche per ogni categoria di pattern cellulare: stringhe singole = SS, stringhe doppie = DS, piccoli cluster = SC, grandi cluster = BC, diffusi e moduli di Young.
3. Nella scheda di visualizzazione dati, immettere i dati dei moduli di Young misurati per ciascuna delle categorie di pattern cellulari corrispondenti. Analizzare la distribuzione dei dati selezionando Analizza dalla barra dei menu, quindi Analisi esplorativa dei dati.
4. Selezionate Moduli di Young come variabile dipendente e Pattern cellulare come elenco dei fattori. Un box plot utilizzato per la sezione dei risultati viene visualizzato tra i risultati nel file di output.
5. Per eseguire un'analisi statistica, scegliere Campioni dipendenti (Dependent Samples) nella sezione test non parametrico della scheda della barra dei menu di analisi. Selezionare Young's Moduli come Test Fields e Cellular Pattern as Groups (Gruppi) nella scheda Fields.
   NOTA: I risultati vengono visualizzati nel file di output. Per l'analisi statistica viene eseguito un test di Friedman.
6. Incorporare i valori p del test non parametrico nel box plot creato nel passaggio 4.4. Salvare i risultati facendo clic su File nella barra dei menu e selezionando Salva.

Risultati

Utilizzando un dispositivo di taglio autocostruito, siamo stati in grado di espiantare e generare piccoli dischi di cartilagine (4 mm x 1 mm) da condili umani freschi contenenti un singolo modello spaziale cellulare³⁰ di singole stringhe (SS, Figura 2A), doppie stringhe (DS), piccoli cluster (SC), grandi cluster (BC; Figura 2A) e diffusa (Figura 2B). Un espianto di cartilagine rappresentativo è raffigurato n...

Discussione

Essendo una malattia progressiva e multifattoriale, l'OA innesca cambiamenti strutturali e funzionali nella cartilagine articolare. Durante il decorso dell'OA, le compromissioni delle caratteristiche meccaniche sono accompagnate da cambiamenti strutturali e biochimici sulla superficie della cartilagine articolare^27,31. I primi eventi patologici che si verificano nell'OA sono la deplezione dei proteoglicani accoppiata con l'interruzione della rete di collagene

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium