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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo un approccio passo-passo per identificare e affrontare i problemi più comuni associati alle micro-indentazioni di microscopia a forza atomica. Esemplificamo i problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare umana nativa caratterizzati da vari gradi di degenerazione guidata dall'osteoartrite.

Abstract

Senza dubbio, la microscopia a forza atomica (AFM) è attualmente una delle tecniche più potenti e utili per valutare micro e persino nano-segnali in campo biologico. Tuttavia, come con qualsiasi altro approccio microscopico, possono sorgere sfide metodologiche. In particolare, le caratteristiche del campione, la preparazione del campione, il tipo di strumento e la sonda di indentazione possono portare ad artefatti indesiderati. In questo protocollo, esemplificamo questi problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare sana e osteoartritica. A tal fine, mostriamo innanzitutto attraverso un approccio passo-passo come generare, classificare e classificare visivamente i dischi di cartilagine articolare ex vivo in base ai diversi stadi di degenerazione per mezzo di un grande imaging a fluorescenza a mosaico 2D dell'intero tessuto espianto. Il principale punto di forza del modello ex vivo è che comprende cartilagine umana invecchiata, nativa, che consente di studiare i cambiamenti correlati all'osteoartrite dall'esordio precoce alla progressione. Inoltre, vengono presentate anche le insidie comuni nella preparazione dei tessuti, nonché l'effettiva procedura AFM insieme alla successiva analisi dei dati. Mostriamo come le fasi di base ma cruciali come la preparazione e l'elaborazione del campione, le caratteristiche topografiche del campione causate dalla degenerazione avanzata e l'interazione campione-punta possano influire sull'acquisizione dei dati. Sottoponiamo inoltre ad esame i problemi più comuni nell'AFM e descriviamo, ove possibile, come superarli. La conoscenza di questi limiti è della massima importanza per la corretta acquisizione dei dati, l'interpretazione e, in ultima analisi, l'integrazione dei risultati in un ampio contesto scientifico.

Introduzione

A causa delle dimensioni sempre più ridotte dei dispositivi e dei sistemi elettronici, il rapido sviluppo di tecnologie e apparecchiature a base di micro e nano ha guadagnato slancio. Uno di questi dispositivi è la microscopia a forza atomica (AFM), che può scansionare superfici biologiche e recuperare informazioni topografiche o biomeccaniche su scala nanometricae micrometrica 1,2. Tra le sue vaste caratteristiche, questo strumento può essere utilizzato sia come micro che come nano-penetratore per ottenere informazioni sulle proprietà meccaniche di vari sistemi biologici 3,4,5,6.<....

Protocollo

Sono stati utilizzati condili femorali prelevati da pazienti sottoposti ad artroplastica totale del ginocchio presso l'ospedale universitario di Tubinga, in Germania. In questo studio sono stati inclusi solo campioni di cartilagine articolare di pazienti con patologie articolari degenerative e post-traumatiche. Prima dell'inizio dello studio è stata ottenuta l'approvazione del comitato etico dipartimentale, istituzionale e locale (Progetto n.674/2016BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della partecipazione.

NOTA: Nella Figura 1 è riportato un diagramma di flusso delle f....

Risultati

Utilizzando un dispositivo di taglio autocostruito, siamo stati in grado di espiantare e generare piccoli dischi di cartilagine (4 mm x 1 mm) da condili umani freschi contenenti un singolo modello spaziale cellulare30 di singole stringhe (SS, Figura 2A), doppie stringhe (DS), piccoli cluster (SC), grandi cluster (BC; Figura 2A) e diffusa (Figura 2B). Un espianto di cartilagine rappresentativo è raffigurato n.......

Discussione

Essendo una malattia progressiva e multifattoriale, l'OA innesca cambiamenti strutturali e funzionali nella cartilagine articolare. Durante il decorso dell'OA, le compromissioni delle caratteristiche meccaniche sono accompagnate da cambiamenti strutturali e biochimici sulla superficie della cartilagine articolare27,31. I primi eventi patologici che si verificano nell'OA sono la deplezione dei proteoglicani accoppiata con l'interruzione della rete di collagene

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo i chirurghi ortopedici del Dipartimento di Chirurgia Ortopedica dell'Ospedale Universitario di Tubinga per aver fornito i campioni di tessuto.

....

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BMerck KGaA, Darmstadt, Germany1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyJPK00518
Biocompatible sample glue Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyH000033
Calcein AMCayman, Ann Arbor, Michigan, USA14948Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
CantileverBruker Nano GmbH, Berlin, GermanySAA-SPH-5UMFrequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device Self-made n/aCutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFMThe Imaging Source Europe GmbH, Bremen, GermanyDFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscopeLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyCM3050S 
Data Processing Software for the AFMBruker Nano GmbH, Berlin, Germanyn/aVersion 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, Germany11889113
Glass block cantiliver holderBruker Nano GmbH, Berlin, GermanySP-90-05Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF1315
Microscope glass slidesSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USACLS294775X50
Mounting medium With DAPIibidi GmbH, Gräfelfing, Germany50011Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-StreptomycinSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyT-05-0117
ScalpelFeather Medical Products, Osaka, Japan2023-01
Silicone SkirtBruker Nano GmbH, Berlin, Germanyn/aProtective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSSIBM, Armonk, New York, USASPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, NetherlandsSA6255012Water-soluble embedding medium 

Riferimenti

  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force....

Ristampe e Autorizzazioni

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