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Presentiamo un approccio passo-passo per identificare e affrontare i problemi più comuni associati alle micro-indentazioni di microscopia a forza atomica. Esemplificamo i problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare umana nativa caratterizzati da vari gradi di degenerazione guidata dall'osteoartrite.
Senza dubbio, la microscopia a forza atomica (AFM) è attualmente una delle tecniche più potenti e utili per valutare micro e persino nano-segnali in campo biologico. Tuttavia, come con qualsiasi altro approccio microscopico, possono sorgere sfide metodologiche. In particolare, le caratteristiche del campione, la preparazione del campione, il tipo di strumento e la sonda di indentazione possono portare ad artefatti indesiderati. In questo protocollo, esemplificamo questi problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare sana e osteoartritica. A tal fine, mostriamo innanzitutto attraverso un approccio passo-passo come generare, classificare e classificare visivamente i dischi di cartilagine articolare ex vivo in base ai diversi stadi di degenerazione per mezzo di un grande imaging a fluorescenza a mosaico 2D dell'intero tessuto espianto. Il principale punto di forza del modello ex vivo è che comprende cartilagine umana invecchiata, nativa, che consente di studiare i cambiamenti correlati all'osteoartrite dall'esordio precoce alla progressione. Inoltre, vengono presentate anche le insidie comuni nella preparazione dei tessuti, nonché l'effettiva procedura AFM insieme alla successiva analisi dei dati. Mostriamo come le fasi di base ma cruciali come la preparazione e l'elaborazione del campione, le caratteristiche topografiche del campione causate dalla degenerazione avanzata e l'interazione campione-punta possano influire sull'acquisizione dei dati. Sottoponiamo inoltre ad esame i problemi più comuni nell'AFM e descriviamo, ove possibile, come superarli. La conoscenza di questi limiti è della massima importanza per la corretta acquisizione dei dati, l'interpretazione e, in ultima analisi, l'integrazione dei risultati in un ampio contesto scientifico.
A causa delle dimensioni sempre più ridotte dei dispositivi e dei sistemi elettronici, il rapido sviluppo di tecnologie e apparecchiature a base di micro e nano ha guadagnato slancio. Uno di questi dispositivi è la microscopia a forza atomica (AFM), che può scansionare superfici biologiche e recuperare informazioni topografiche o biomeccaniche su scala nanometricae micrometrica 1,2. Tra le sue vaste caratteristiche, questo strumento può essere utilizzato sia come micro che come nano-penetratore per ottenere informazioni sulle proprietà meccaniche di vari sistemi biologici 3,4,5,6.<....
Sono stati utilizzati condili femorali prelevati da pazienti sottoposti ad artroplastica totale del ginocchio presso l'ospedale universitario di Tubinga, in Germania. In questo studio sono stati inclusi solo campioni di cartilagine articolare di pazienti con patologie articolari degenerative e post-traumatiche. Prima dell'inizio dello studio è stata ottenuta l'approvazione del comitato etico dipartimentale, istituzionale e locale (Progetto n.674/2016BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della partecipazione.
NOTA: Nella Figura 1 è riportato un diagramma di flusso delle f....
Utilizzando un dispositivo di taglio autocostruito, siamo stati in grado di espiantare e generare piccoli dischi di cartilagine (4 mm x 1 mm) da condili umani freschi contenenti un singolo modello spaziale cellulare30 di singole stringhe (SS, Figura 2A), doppie stringhe (DS), piccoli cluster (SC), grandi cluster (BC; Figura 2A) e diffusa (Figura 2B). Un espianto di cartilagine rappresentativo è raffigurato n.......
Essendo una malattia progressiva e multifattoriale, l'OA innesca cambiamenti strutturali e funzionali nella cartilagine articolare. Durante il decorso dell'OA, le compromissioni delle caratteristiche meccaniche sono accompagnate da cambiamenti strutturali e biochimici sulla superficie della cartilagine articolare27,31. I primi eventi patologici che si verificano nell'OA sono la deplezione dei proteoglicani accoppiata con l'interruzione della rete di collagene
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamo i chirurghi ortopedici del Dipartimento di Chirurgia Ortopedica dell'Ospedale Universitario di Tubinga per aver fornito i campioni di tessuto.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amphotericin B | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1397-89-3 | |
Atomic force microscop (AFM) head | CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | JPK00518 | |
Biocompatible sample glue | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | H000033 | |
Calcein AM | Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA | 14948 | Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging |
Cantilever | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SAA-SPH-5UM | Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm, geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius |
Cartilage ctting device | Self-made | n/a | Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm |
CDD camera integrated in the AFM | The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany | DFK 31BF03 | |
CDD camera integrated in the fluorescence microscope | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DFC3000G | |
Cryotome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM3050S | |
Data Processing Software for the AFM | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Version 5.0.86, can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 11889113 | |
Glass block cantiliver holder | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SP-90-05 | Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker). |
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F1315 | |
Microscope glass slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS294775X50 | |
Mounting medium With DAPI | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 50011 | Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs side view imaging |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4333 | |
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
Scalpel | Feather Medical Products, Osaka, Japan | 2023-01 | |
Silicone Skirt | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent medium condensation in the AFM head. |
Statistical program - SPSS | IBM, Armonk, New York, USA | SPSS Statistics 22 | Vesion 280.0.0.0 (190) |
Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 | Water-soluble embedding medium |
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