Abordaje de cuestiones prácticas en la microindentación basada en microscopía de fuerza atómica en explantes de cartílago articular humano

Resumen

Presentamos un enfoque paso a paso para identificar y abordar los problemas más comunes asociados con las microindentaciones de microscopía de fuerza atómica. Ejemplificamos los problemas emergentes en los explantes nativos de cartílago articular humano caracterizados por varios grados de degeneración impulsada por la osteoartritis.

Resumen

Sin lugar a dudas, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es actualmente una de las técnicas más potentes y útiles para evaluar micro e incluso nano-señales en el campo biológico. Sin embargo, al igual que con cualquier otro enfoque microscópico, pueden surgir desafíos metodológicos. En particular, las características de la muestra, la preparación de la muestra, el tipo de instrumento y la sonda de indentación pueden dar lugar a artefactos no deseados. En este protocolo, ejemplificamos estos problemas emergentes en explantes de cartílago articular sanos y osteoartríticos. Con este fin, primero mostramos a través de un enfoque paso a paso cómo generar, clasificar y clasificar visualmente discos de cartílago articular ex vivo de acuerdo con diferentes etapas de degeneración mediante imágenes de fluorescencia de mosaico 2D de gran tamaño de los explantes de tejido completo. La principal fortaleza del modelo ex vivo es que comprende cartílago humano nativo envejecido que permite la investigación de los cambios relacionados con la osteoartritis desde el inicio temprano hasta la progresión. Además, también se presentan los errores más comunes en la preparación de los tejidos, así como el procedimiento real de MFA junto con el posterior análisis de los datos. Mostramos cómo los pasos básicos pero cruciales, como la preparación y el procesamiento de la muestra, las características topográficas de la muestra causadas por la degeneración avanzada y la interacción muestra-punta, pueden afectar la adquisición de datos. También sometemos a escrutinio los problemas más comunes en la AFM y describimos, en la medida de lo posible, cómo superarlos. El conocimiento de estas limitaciones es de suma importancia para la correcta adquisición de datos, la interpretación y, en última instancia, la incorporación de los hallazgos en un contexto científico amplio.

Introducción

Debido al tamaño cada vez menor de los dispositivos y sistemas electrónicos, el rápido desarrollo de la tecnología y los equipos basados en micro y nano ha cobrado impulso. Uno de estos dispositivos es la microscopía de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés), que puede escanear superficies biológicas y recuperar información topográfica o biomecánica a escalas nanométricas y micrométricas ^1,2. Entre sus vastas características, esta herramienta puede ser operada como micro y nano indentador para obtener información sobre las propiedades mecánicas de diversos sistemas biológicos 3,4,5,6. Los datos se recogen por contacto físico con la superficie a través de una sonda mecánica, que puede ser tan pequeña como aproximadamente 1 nm en su punta⁷. A continuación, se muestra la deformación resultante de la muestra en función de la profundidad de indentación de la punta en voladizo y la fuerza aplicada sobre la muestra⁸.

La osteoartritis (OA) es una enfermedad crónica degenerativa a largo plazo caracterizada por el deterioro del cartílago articular en las articulaciones y los tejidos circundantes, lo que puede conducir a la exposición completa de las superficies óseas. La carga de la OA es considerable; actualmente, la mitad de las mujeres y un tercio de los hombres de 65 años o más sufren de OA⁹. Los traumatismos, la obesidad y la consiguiente alteración de la biomecánica de la articulación¹⁰ determinan la degeneración del cartílago articular, que se considera un resultado final común. El estudio pionero de Ganz et al. postuló que los primeros pasos del proceso de artrosis pueden involucrar las propiedades biomecánicas del cartílago¹¹, y desde entonces los investigadores han confirmado esta hipótesis¹². Del mismo modo, es generalmente aceptado que las propiedades biomecánicas del tejido están orquestadas funcionalmente por la organización ultraestructural, así como por la diafonía célula-célula y célula-matriz. Cualquier alteración puede afectar drásticamente el funcionamiento biomecánico general de los tejidos¹³. Hasta la fecha, el diagnóstico de la artrosis es clínico y se basa en la radiografía simple¹⁴. Este enfoque tiene dos caras: en primer lugar, la falta de un umbral de corte degenerativo definido para formular el diagnóstico de OA hace que la afección sea difícil de cuantificar y, en segundo lugar, los métodos de imagen carecen de sensibilidad y estandarización y no pueden detectar daños localizados en el cartílago^15,16,17. Para ello, la evaluación de las propiedades mecánicas del cartílago tiene la ventaja decisiva de que describe un parámetro que cambia durante el curso de la artrosis, independientemente de la etiología de la enfermedad, y que tiene una influencia directa en la funcionalidad tisular en una fase muy temprana. Los instrumentos de indentación miden la fuerza con la que el tejido resiste la indentación. De hecho, este no es un concepto nuevo; Los primeros estudios se remontan a las décadas de 1980 y 1990. En este período, numerosos estudios sugirieron que los instrumentos de indentación diseñados para las mediciones artroscópicas del cartílago articular podrían ser adecuados para detectar cambios degenerativos en el cartílago. Incluso hace 30 años, algunos estudios pudieron demostrar que los instrumentos de indentación eran capaces de detectar in vivo cambios en la superficie del cartílago durante la degeneración tisular mediante la realización de mediciones de rigidez compresiva durante la artroscopia^18,19,20.

La indentación de AFM (AFM-IT) del cartílago articular proporciona información sobre una propiedad mecánica fundamental del tejido, a saber, la rigidez. Se trata de un parámetro mecánico que describe la relación entre una carga aplicada no destructiva y la deformación resultante del área tisular dentada²¹. Se ha demostrado que AFM-IT es capaz de cuantificar las modificaciones de la rigidez dependientes de la edad en redes de colágeno macroscópicamente no afectadas, diferenciando así entre los cambios patológicos asociados a la aparición de la artrosis (grado 0 en la escala de Outerbridge en cartílago articular)²². Hemos demostrado previamente que los AFM-IT, sobre la base de la organización espacial de los condrocitos como un biomarcador basado en imágenes para la degeneración temprana del cartílago, permiten no solo cuantificar, sino también identificar los cambios mecánicos degenerativos más tempranos. Estos hallazgos ya han sido confirmados por otros^23,24. Por lo tanto, AFM-IT actúa como una herramienta interesante para diagnosticar e identificar cambios degenerativos tempranos. Estos cambios ya se pueden medir a nivel celular, remodelando la comprensión del proceso fisiopatológico de la artrosis.

En este protocolo, demostramos un procedimiento completo de clasificación histológica y biomecánica de explantes de cartílago articular, desde la preparación del explante de cartílago nativo hasta la adquisición y procesamiento de datos de AFM. A través de un enfoque paso a paso, mostramos cómo generar, clasificar y clasificar visualmente el tejido del cartílago articular de acuerdo con las diferentes etapas de degeneración mediante imágenes de mosaico grande en 2D, seguidas de indentaciones de micro-AFM.

A pesar de que, en la actualidad, la AFM-IT es una de las herramientas más sensibles para medir los cambios biomecánicos en el cartílago⁷, como cualquier otra técnica instrumental, tiene limitaciones y peculiaridades prácticas²⁵ que pueden llevar a la adquisición errónea de datos. Con este fin, sometemos a escrutinio los problemas más comunes que surgen durante las mediciones de AFM de los explantes de cartílago y describimos, en la medida de lo posible, cómo minimizarlos o superarlos. Estos incluyen los aspectos topográficos de las muestras y las dificultades para estabilizarlas en un entorno compatible con AFM, las peculiaridades físicas de la superficie del tejido y las dificultades resultantes para realizar mediciones de AFM en dichas superficies. También se presentan ejemplos de curvas fuerza-distancia erróneas, haciendo hincapié en las condiciones que pueden causarlas. También se discuten las limitaciones adicionales inherentes a la geometría de la punta en voladizo y el uso del modelo Hertz para el análisis de datos.

Protocolo

Se utilizaron cóndilos femorales recogidos de pacientes sometidos a artroplastia total de rodilla en el Hospital Universitario de Tübingen, Alemania. Solo se incluyeron en este estudio muestras de cartílago articular de pacientes con patologías articulares degenerativas y postraumáticas. Antes del inicio del estudio se obtuvo la aprobación de los comités de ética departamentales, institucionales y locales (Proyecto n.º 674/2016BO2). Se recibió el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de participar.

NOTA: En la Figura 1 se presenta un diagrama de flujo de los pasos del experimento en su orden cronológico.

1. Procesamiento tisular y generación de discos cartilaginosos

1. Preparación de tejidos
   1. Después de la resección postoperatoria, coloque las muestras de cartílago en un recipiente lleno de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con penicilina-estreptomicina al 5% (v/v). Asegúrese de que las muestras estén completamente sumergidas en el medio. El tiempo transcurrido entre la resección quirúrgica y el tratamiento posterior del cartílago no debe exceder las 24 h. Asegúrese de que, a lo largo de todo el proceso, las muestras estén completamente sumergidas en medios para evitar que se sequen.
   2. Corta el cartílago del hueso con un bisturí.
2. Generación de discos de cartílago
   1. Generar discos de cartílago de 4 mm de diámetro utilizando un punzón de biopsia.
      NOTA: Es importante seleccionar y resecar las zonas del cóndilo donde el espesor de la capa de cartílago supere 1 mm. Esto puede ser problemático, especialmente alrededor de las zonas de carga, donde la capa de cartílago generalmente pierde su grosor debido a procesos de desgaste o degeneración.
   2. Coloque los discos de cartílago de 4 mm generados previamente en un dispositivo de corte hecho a medida y fije y mantenga estables los discos de cartílago mediante una espátula. Al colocar los discos de cartílago en el dispositivo de corte, se debe tener cuidado. Coloque las muestras de modo que la capa superior del cartílago (la zona superficial del cartílago articular) no quede frente a la cuchilla
   3. Corta los discos de cartílago con una cuchilla de afeitar. De este modo, se generan muestras de cartílago en forma de disco de 4 mm x 1 mm. Para evitar que la muestra se seque, realice el corte del tejido lo más rápido posible.
   4. Recoja cada disco con la ayuda de una espátula y coloque los discos de cartílago generados en tubos de 1,5 ml que contengan 1 ml de DMEM suplementado con penicilina-estreptomicina al 5% (v/v). Coloque aproximadamente 15 discos en un tubo.
3. Corte criotomos de los discos de cartílago (para cortes perpendiculares)
   NOTA: Este paso es opcional y se puede emplear si se desea una visualización lateral de la distribución del patrón celular dentro de los discos cartilaginosos. Se puede utilizar como método de verificación, ya que la distribución del patrón celular es una característica 3D del cartílago articular²⁶. También se puede utilizar el corte óptico y las reconstrucciones en 3D de los discos cartilaginosos completos utilizando un microscopio confocal, eliminando, por lo tanto, la necesidad de seccionar las muestras como se describe en el protocolo.
   1. Cubra el disco cartilaginoso con medio de inclusión soluble en agua y colóquelo en su borde en la perilla de criotomo (con la superficie del disco perpendicular a la superficie de la perilla). En el dispositivo criotomo, el medio de inclusión se congela a bajas temperaturas.
   2. Con un criotomo estándar, seccione el tejido lateralmente con un grosor de 60 μm hasta llegar a la mitad del disco (es decir, cuando las criosecciones alcancen una longitud de 4 mm) y recoja las rodajas. Al seccionar el explante discal perpendicularmente, se pueden visualizar todas las zonas del cartílago (superficial, medio y profundo).
   3. Recoja las secciones en un portaobjetos de vidrio y retire el medio de inclusión soluble en agua lavando tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).

2. Clasificación del disco cartilaginoso en función del patrón espacial celular

1. Tinción de las muestras de cartílago en forma de disco
   1. Colocar un disco de cartílago (sección 1.2) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y añadir 130 μL de colorante de fluorescencia permeable a la célula a una dilución de 1:1.000 en cada pocillo.
   2. Inspeccione visualmente toda la placa y asegúrese de que solo se coloque un disco en cada pocillo. Incubar la placa durante 30 min en la incubadora de cultivo celular estándar a 37 °C.
2. Tinción de las rodajas de cartílago de 60 μm
   1. Coloque suavemente las secciones del disco de cartílago (sección 1.3) sobre portaobjetos de microscopio de vidrio con la ayuda de fórceps.
   2. Cubra las secciones de cartílago con un medio de montaje que contenga contratinción nuclear DAPI y coloque suavemente cubreobjetos que sean adecuados para microscopía de fluorescencia.
   3. Sella los bordes de cada cubreobjetos con esmalte de uñas transparente normal y déjalo secar durante 3 minutos.
3. Clasificación e imágenes del cartílago de arriba hacia abajo y de lado
   NOTA: Cada disco debe examinarse bajo un microscopio fluorescente. El objetivo de este paso es clasificar los discos en función de su patrón celular predominante (cuerdas simples, cuerdas dobles, grupos pequeños, grupos grandes o difusos).
   1. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa del microscopio de fluorescencia.
   2. Seleccione el filtro de fluorescencia adecuado de Em 495 nm/Ex 515 nm (para la obtención de imágenes de arriba hacia abajo de los discos de cartílago preparado en la sección 2.1.) o Em 358 nm/Ex 461 nm (para la obtención de imágenes de visión lateral de las secciones de cartílago preparadas en la sección 2.2) y el objetivo 10x.
      NOTA: El uso del objetivo 10x permite inspeccionar toda la circunferencia del disco y se pueden excluir las muestras con tinción no homogénea o inadecuada. Sin embargo, el uso de solo la vista de arriba hacia abajo puede resultar en la percepción de cambios en la organización celular como resultado del análisis de las capas de tejido más profundas que se hacen visibles a la observación de arriba hacia abajo por la erosión superficial. A modo de ejemplo, una cadena ascendente que sigue las arcadas de colágeno podría percibirse como una sola célula o como células dispersas (patrón difuso)²⁶. Como resultado, ambos lados de los discos deben inspeccionarse para garantizar la selección adecuada del patrón celular.
   3. Determinar visualmente el patrón celular que se muestra en cada disco cartilaginoso. Es poco probable que un disco tenga un solo tipo de patrón celular. Para la parte del disco en la que la disposición de los condrocitos no coincide con el patrón de interés, acepte las muestras solo si el patrón no deseado se encuentra en la periferia, donde no se están realizando mediciones de AFM (es decir, hasta 0,5 mm del borde del disco), y asegúrese de que esto no exceda el 10% de la superficie total del disco^{27, Artículo 28}.
4. Adquisición de imágenes de todos los discos cartilaginosos
   1. Seleccione el objetivo 10x del microscopio y colóquelo debajo del pocillo preseleccionado que contiene un disco de cartílago individual. Concéntrese en el disco para ver el patrón celular.
   2. Seleccione la función Navegador para obtener una visión general de todo el pozo. Utilice el botón izquierdo del ratón y arrastre para desplazarse a una posición diferente del escenario. Con la rueda del ratón, acérquese y aléjese.
      NOTA: En este punto, se puede ver una vista previa del pozo con toda la muestra haciendo doble clic en cada área de interés secuencialmente.
   3. Seleccione un cuadrado que abarque el área de interés que se va a escanear; En este punto, todas las baldosas individuales que componen el mosaico se volverán visibles.
   4. Ajuste la exposición/intensidad de la luz para que las celdas se puedan visualizar claramente desde el fondo. En este punto, el brillo/contraste de la imagen se ha ajustado para todos los mosaicos y ya no se puede personalizar individualmente para cada mosaico.
      NOTA: Como las celdas cercanas al borde del disco a menudo emiten una señal de fluorescencia más alta que las celdas en el centro, se deben adaptar los ajustes de exposición/intensidad de luz.
      1. Para evaluar si el tiempo de exposición es apropiado para un canal en particular, examine la distribución de la señal en el histograma. Mediante el uso del mecanismo de exposición automática incluido en el software de imagen del microscopio, visualice todas las células que residen dentro del disco.
   5. Seleccione la opción Punto de mapa de enfoque del software y, a continuación, seleccione cada mosaico individual haciendo clic con el botón izquierdo en el centro del mismo.
   6. Seleccione la opción Mapa de enfoque. Se muestra una ventana con todos los mosaicos seleccionados anteriormente. Haga doble clic en un mosaico de la lista para mostrarlo y enfocarlo correctamente.
   7. Haga clic en Establecer Z para guardar el plano focal y pasar al siguiente mosaico. Después de ajustar el plan focal para cada mosaico individual, comience la adquisición de imágenes pulsando Iniciar escaneo.
      1. Si el escaneo muestra barras horizontales y/o verticales más oscuras, esto puede deberse a una iluminación inadecuada y desigual de los fotogramas individuales. Resuelva esto utilizando la opción Sombreado vinculado incorporada en el software antes del escaneo real.
   8. Guarde, exporte y anote correctamente las imágenes.

3. Abordaje biomecánico de los explantes de cartílago

1. Preparación de muestras para mediciones de AFM
   1. Fijar cada disco cartilaginoso preseleccionado que contenga un patrón celular (sección 2) en placas de Petri mediante pegamento biocompatible. Agregue suficiente pegamento de muestra en los lados superior, inferior, izquierdo y derecho del disco.
   2. Cubra los discos con 2,5 ml de medio L-15 de Leibovitz sin L-glutamina. Agregue el medio Leibowitz suavemente sobre las muestras para evitar que la muestra se desprenda de la superficie debido a las ondas creadas por el medio.
2. Carga de las muestras en el AFM
   1. Coloque la placa de Petri en el portamuestras del dispositivo AFM y encienda el calentador de placa de Petri ajustado a 37 °C. Deje que la placa de cultivo de tejidos alcance la temperatura deseada. Esto se hace para excluir posibles artefactos causados por la variación de temperatura.
3. Calibración AFM-voladizo
   1. Inicialice la configuración del software como lo describieron anteriormente Danalache et ^al.29.
   2. Seleccione un soporte en voladizo de bloque de vidrio adecuado para las mediciones de líquidos y colóquelo con cuidado en el cabezal AFM. Un mecanismo de bloqueo asegura el bloque de vidrio en el cabezal AFM. Asegúrese de que la superficie reflectante del bloque de vidrio esté recta y paralela al soporte AFM.
   3. Coloque el voladizo en la superficie del soporte del voladizo de bloque de vidrio con cuidado. El voladizo en sí debe descansar en el plano óptico pulido, en el centro del bloque de vidrio.
   4. Coloque con cuidado un faldón de silicona (membrana de silicona) en la base del soporte en voladizo para evitar la condensación del medio en el cabezal AFM.
   5. Baje el voladizo en pasos de 100 μm utilizando la función de motor paso a paso hasta que esté completamente sumergido en el medio.
   6. Ejecute un enfoque de escáner con los parámetros de aproximación descritos por Danalache et ^al.29. Retraiga el voladizo 100 μm una vez que se alcance el fondo de la placa de Petri.
   7. Calibrar el voladizo siguiendo los pasos exactos y ejecutar los parámetros descritos por Danalache et ^al.29. Al final de la calibración, la deflexión vertical se guarda y se muestra en newton (N) unidades de fuerza en lugar de voltios (V), la unidad del registro original por el detector de fotodiodos. En los experimentos aquí, se obtuvo un punto de ajuste de 4,47 nN después de la calibración.
   8. Utilizando la función de motor paso a paso, retraiga el voladizo a 1.000 μm.
4. Identificación del sitio de medición de cartílago deseado bajo el AFM
   NOTA: Debido al grosor de 1 mm de los discos de cartílago, el voladizo no es visible en el campo de visión mientras se navega sobre la muestra.
   1. Utilice la cámara CCD del microscopio para identificar el voladizo. El voladizo AFM debe colocarse en un área libre de muestras de la placa de Petri.
   2. Inicie un enfoque de escáner con el voladizo en un área limpia y libre de muestras de la placa de Petri, utilizando los mismos parámetros descritos por Danalache et ^al.29.
   3. Retraiga aún más el voladizo a 1,5 mm de distancia de la parte inferior de la placa con el control del motor paso a paso. Este paso es crucial para evitar una colisión directa entre el voladizo y la muestra.
   4. Cambie de la vista de campo claro a la de fluorescencia e identifique visualmente la parte superior del disco.
   5. Mueva el portamuestras AFM exactamente 2 mm hacia el centro del disco. Este punto se considera el centro del disco cartilaginoso.
   6. Ejecute un enfoque de escáner y, una vez alcanzada la superficie del disco cartilaginoso, retraiga el voladizo 100 μm.
5. Mediciones de la curva fuerza-distancia
   1. Detalle de las celdas colocadas en el lugar de medición deseado. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar las mediciones y la generación de curvas fuerza-distancia en la posición de destino.
   2. Adquiera cinco curvas de fuerza-distancia en cada sitio de medición. Retraiga el voladizo 500 μm y muévalo al siguiente sitio de medición.
      NOTA: La retracción del voladizo es un paso crucial, ya que la superficie del disco cartilaginoso no es homogénea y tiene irregularidades. Un montículo alto en la superficie de la muestra puede provocar una colisión dramática, lo que provocará daños no deseados en la punta del voladizo/muestra. Recomendamos seleccionar un mínimo de cinco sitios de medición diferentes dispersos por la superficie del disco y adquirir un mínimo de cinco curvas de fuerza-distancia en cada sitio.
   3. Inspeccione las curvas fuerza-distancia y guárdelas.
6. Estimación de los módulos de Young mediante el modelo de ajuste de Hertz
   1. Abra las curvas de fuerza-distancia generadas que se van a analizar (archivo .jpk) en el software de análisis de datos utilizando la opción Abrir un lote de curvas de espectroscopia .
   2. Seleccione el modelo de ajuste Hertz y, a continuación, seleccione la opción Ajuste de elasticidad .
      1. La opción de ajuste de elasticidad realiza automáticamente los siguientes cálculos en la curva fuerza-distancia seleccionada: calcula la línea base y resta de toda la curva para eliminar el desplazamiento de la línea base (la línea base vuelve a cero en el eje y); determina el punto de contacto detectando el punto en el que la curva fuerza-distancia cruza la línea de fuerza cero (el punto de contacto se establece en cero en el eje x); calcula la separación entre la punta y la muestra (se resta la señal de altura del piezoeléctrico que tiene en cuenta la flexión del voladizo); y ajusta la curva fuerza-distancia automáticamente con el modelo seleccionado. Si se desea, cada uno de estos pasos también se puede llevar a cabo de forma independiente.
   3. Adáptese utilizando los siguientes parámetros de ajuste: relación de Poisson de 0,5 y el radio de punta en voladizo adecuado.
      NOTA: Cuando se utiliza un voladizo con una punta esférica en voladizo, se debe utilizar el modelo de ajuste Hertz. El voladizo utilizado en este estudio tenía una punta esférica con un radio de 5 μm. Recomendamos ajustar la curva fuerza-distancia hasta que se alcance la fuerza máxima aplicada (punto de ajuste).
   4. Compruebe visualmente el ajuste de la curva fuerza-distancia para garantizar su corrección. Este paso debe realizarse para cada una de las curvas fuerza-distancia analizadas.
7. Determinación de la profundidad de indentación
   NOTA: Dependiendo de la herramienta de análisis de datos que se utilice, este proceso puede diferir. El experimentador puede leer fácilmente la profundidad de indentación siguiendo una serie de pasos que se incluyen en el programa de análisis de datos.
   1. Abra cada una de las curvas de fuerza-distancia generadas en el software de análisis de datos y seleccione el modelo de ajuste de hercios como proceso de análisis.
   2. Aplique la opción Restar desplazamiento de línea base para poner a cero el eje de deflexión vertical (eje Y) y seleccione la función Desplazamiento + Inclinación .
   3. Utilice la función Buscar punto de contacto para identificar automáticamente el punto de contacto , que se lleva automáticamente a una coordenada x de cero.
   4. Reste la distancia teniendo en cuenta únicamente la deflexión en voladizo de la altura piezoeléctrica bruta durante la indentación utilizando la función Posición vertical de la punta .
   5. Seleccione la opción Ajuste de elasticidad para mostrar la curva fuerza-distancia procesada y seleccione el área del gráfico para que se alinee con el valor más negativo en el eje de posición vertical de la punta (eje x).
   6. Lea y documente la sangría desde el cuadro X Min en la pestaña de parámetros. Guarde y documente los resultados.

4. Análisis estadístico

1. Abra el software estadístico. Seleccione Nuevo conjunto de datos en el menú desplegable.
2. Abra la pestaña Vista de variables después de seleccionar el archivo DataSet . Defina las variables numéricas para cada categoría de patrón celular: cadenas simples = SS, cadenas dobles = DS, grupos pequeños = SC, grupos grandes = BC, difusos y módulos de Young.
3. En la pestaña de vista de datos, introduzca los datos de los módulos de Young medidos para cada una de las categorías de patrones celulares correspondientes. Analice la distribución de datos seleccionando Analizar en la barra de menús y, a continuación, Análisis exploratorio de datos.
4. Seleccione los módulos de Young como variable dependiente y el patrón celular como lista de factores. Un diagrama de caja utilizado para la sección de resultados se muestra entre los resultados del archivo de salida.
5. Para realizar un análisis estadístico, elija Muestras dependientes en la sección de prueba no paramétrica de la pestaña de la barra de menús Analizar. Seleccione Módulos de Young como Campos de Prueba y Patrón Celular como Grupos en la pestaña de campos.
   NOTA: Los resultados se muestran en el archivo de salida. Para el análisis estadístico se realiza una prueba de Friedman.
6. Incorpore los valores p de la prueba no paramétrica en el diagrama de caja que se creó en el paso 4.4. Guarde los resultados haciendo clic en Archivo en la barra de menús y seleccionando Guardar.

Resultados

Utilizando un dispositivo de corte de fabricación propia, pudimos explantar y generar pequeños discos de cartílago (4 mm x 1 mm) a partir de cóndilos humanos frescos que contenían un patrón espacial celular^{único 30} de cuerdas simples (SS, Figura 2A), cuerdas dobles (DS), grupos pequeños (SC), grupos grandes (BC; Figura 2A) y difusa (Figura 2B). En la Figura 3A se muestra ...

Discusión

Al ser una enfermedad progresiva y multifactorial, la artrosis desencadena cambios estructurales y funcionales en el cartílago articular. A lo largo del curso de la artrosis, las alteraciones en las características mecánicas se acompañan de cambios estructurales y bioquímicos en la superficie del cartílago articular^27,31. Los eventos patológicos más tempranos que ocurren en la OA son la depleción de proteoglicanos junto con la disrupción de la red de co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium