生化学的バイオマーカーを評価する技術は広く利用されていますが、このプロトコルは、新熱帯無尾動物における方法論を標準化および複製するための重要な詳細を示しています。この手法の主な利点は、その低コスト、再現性、およびその応用です。この手法は、内部メラニンの変化を評価するための定量的データを取得するために適用できます。
コメットアッセイは、特定の化合物によって誘発される遺伝毒性の影響を決定できる、高感度で汎用性の高いシンプルな手法です。あらゆるタイプの真核細胞に適用でき、DNA損傷、DNA修復を監視し、細胞の抗酸化状態を評価することができます。まず、ソフトウェアImage-Pro Plus 6.0を開き、メニューとツールバーを生物学的として選択します。
メラニンが占める領域を定量化するには、「測定」を選択し、次に顕微鏡写真の撮影に使用する倍率の空間キャリブレーションを選択します。組織学的画像を開いた後、ツールカウントを選択し、次にオブジェクトを測定します。色とスポイトの選択ツールを使用して、画像で測定する色をマークし、ウィンドウを閉じます。
結果を視覚化するには、カウント、表示、および統計をクリックします。PBS、過酸化水素、およびサンプルの混合物を、光路長1cmの3ミリリットルの石英キュベットでインキュベートします。次に、500マイクロリットルの遠心分離管に保持されているサンプルを取り出し、石英キュベットに加えます。
UV分光光度計で240ナノメートルのカタラーゼ速度論を2分間読み取り、画面に表示される方程式を使用して酵素活性を計算します。採取した血液サンプルを1ミリリットルのPBSで希釈します。381 Gで9分間遠心分離し、ペレットを50ミリリットルのPBSで再懸濁します。
30マイクロリットルの血液サンプルを70マイクロリットルの低融点アガロースまたはLMPAに0.5%濃度のアガロースで混合して、第2層を形成します。50マイクロリットルの層2を、100マイクロリットルの0.5%正常融点アガロースを含む層1で以前にコーティングしたスライド上に置きます。スライドをカバースリップで覆い、摂氏4度の寒さに10分間置いて、レイヤー2を固めます。
固化後、カバースリップをはがします。0.5%LMPAを100マイクロリットル敷き詰めて第3層を形成し、再びスライドを覆います。3番目の層が固まったら、カバーガラスをはがし、同じ日に調製した溶解溶液が入った100ミリリットルのコプリンジャーに各スライドを浸します。
コプリンジャーを摂氏4度の冷水浴に暗闇で1時間入れて、溶解を行います。溶解の最後に、スライドを取り出し、電気泳動タンク内の電気泳動緩衝液に摂氏4度で15分間浸し、DNAを巻き戻します。核DNAを巻き戻した後、同じバッファー上で摂氏4度で25ボルト、250ミリアンペアで10分間電気泳動を行います。
電気泳動の最後に、2ミリリットルのトリス塩溶液を5分間3回加えて、スライド内のサンプルを中和します。サンプルを摂氏4度で95%アルコールを含む100ミリリットルのコプリンジャーに入れて、サンプルを脱水します。スライドの中央に10マイクロリットルのDAPIを加えてサンプルを染色します。
次に、カバースリップでサンプル全体に染料を広げます。NUフィルター付きの蛍光光顕微鏡でスライドを検査します。核様体からのDNA移動の長さを評価することにより、DNA損傷を定量化します。
この場合、重複せずにランダムに選択された100個のセルで視覚的に決定します。次に、DNA損傷を4つのクラスに分類し、0から1は損傷なし、2は最小損傷、3つは中程度の損傷、4つは最大損傷です。データを損傷細胞の平均数と各治療群の平均コメットスコアとして表します。
最後に、これらのデータから、画面に表示されている式を使用して、各試験生物の遺伝的損傷指数またはGDIを計算します。この図は、Boana pulchellaとLeptodactylus luctatorの成虫のスケーリングされた質量指数を示しています。スケーリングされた質量指数の分析では、スケーリング指数を決定するために、種のSVLと体量との間のべき乗関数の関係を示す非線形回帰分析が実行されました。
スケールされた質量指数は、同じ種の成体または幼体のグループを比較するのに役立ちます。Boana ranicepsの肝臓の組織学的セクションがここに提示されています。これらの切片から、肝細胞および肝細胞の核のより多くのcおよびより大きな寸法を観察することができる。
この図には、Boana pulchellaの除草剤シナリオ曝露における細胞遺伝学的バイオマーカーの異なる相補的な応答が示されています。ここでは、黒いバーは 48 時間を示し、灰色のバーは 96 時間を示しています。特定の時間や濃度では損傷を誘発するのに十分ではない可能性があるため、曝露時間と濃度は、ここでは常に要因として考慮する必要があります。
代表的な画像は、バイオマーカーがバイオマーカー応答指数とどのように関連しているかを示しています。ここで、青色は対照群を示し、オレンジ、黄、および緑色はBDE209への曝露シナリオを示しています。このデータは、カタラーゼが、ストレッサーが最高濃度で存在するストレス状況の効果的なバイオマーカーであることを示しています。
体調指数を算出する際は、常に同じ距離から撮影してください。オタマジャクシでは、襟びれを除く総排泄腔管までのSVL体長を測定します。このアプローチは、両生類の生理機能と環境変化の影響に安全に対処します。
侵襲性を示唆するバイオマーカーは他にもありますが、これらの方法は酸化ストレス、トキシコダイナミクス、トキシコジェネティクスに関する知見を提供します。酸化ストレスに関連する追加の酵素測定は、代替の方法論として役立ちます。色差解析技術は、色差に基づいて顕微鏡写真で組織応答を評価します。
顔料システムの場合は、プログラムのキャリブレーションが顕微鏡写真と一致していることを確認してください。この高度な技術は、生体異物が多様な細胞タイプのDNAに直接影響を与えるかどうかを調査するのに役立ち、他の細胞遺伝学的手法では対処できない遺伝物質の酸化的損傷と修復プロセスに関する質問に対処します。
