Несмотря на то, что методы оценки биохимических биомаркеров широко используются, этот протокол содержит важные детали для стандартизации и тиражирования методологии у неотропических бесхвостых. Основным преимуществом этой методики является ее низкая стоимость, воспроизводимость и применение. Этот метод может быть применен для получения количественных данных для оценки изменений во внутреннем меланине.
Анализ комет является чувствительным, универсальным и простым методом, который позволяет определить генотоксические эффекты, вызванные конкретным соединением. Его можно применять к любому типу эукариотических клеток для мониторинга повреждения ДНК, восстановления ДНК и оценки антиоксидантного статуса клеток. Для начала откройте программу Image-Pro Plus 6.0 и выберите меню и панель инструментов как биологические.
Чтобы количественно оценить площадь, занимаемую меланином, выберите «Измерить», затем выберите пространственную калибровку увеличения, используемую для получения микрофотографий на фотографиях. Открыв гистологическое изображение, выберите количество инструментов, а затем измерьте объекты. Отметьте цвет для измерения на изображении с помощью инструмента выбора цветов и пипетки, а затем закройте окно.
Визуализируйте результаты, нажав на «Количество», «Просмотр» и «Статистика». Инкубируйте смесь PBS, перекиси водорода и образца в кварцевой кювете объемом три миллилитра с длиной пути один сантиметр. Затем извлеките образец, хранящийся в центрифужной пробирке объемом 500 микролитров, и добавьте его в кварцевую кювету.
Считайте кинетику каталазы на 240 нанометрах в течение двух минут в ультрафиолетовом спектрофотометре и рассчитайте активность фермента с помощью уравнения, показанного на экране. Разведите собранный образец крови с одним миллилитром PBS. Центрифугируйте его при 381 G в течение девяти минут и повторно суспензируйте гранулу 50 миллилитрами PBS.
Смешайте 30 микролитров образца крови с 70 микролитрами агарозы с низкой температурой плавления или LMPA в концентрации агарозы 0,5% до образования второго слоя. Поместите 50 микролитров второго слоя на предметное стекло, предварительно покрытое первым слоем, содержащим 100 микролитров агарозы 0,5% нормальной температуры плавления. Накройте предметное стекло защитным стеклом и поместите его в холод при температуре четыре градуса Цельсия на 10 минут, чтобы слой застыл второй.
После застывания снимите покровное стекло. Сформируйте третий слой, положив 100 микролитров 0,5% LMPA, и снова накройте горло. После того как третий слой застынет, снимите покровное стекло и погрузите каждое предметное стекло в 100-миллилитровую банку коплина, содержащую раствор лизиса, приготовленный в тот же день.
Поместите банки с коплином в холодную ванну при температуре четыре градуса Цельсия на один час в темноте, чтобы произошел лизис. В конце лизиса извлеките предметные стекла и погрузите их в буферный раствор для электрофореза в резервуаре для электрофореза на 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы позволить ДНК раскрутиться. После раскручивания ядерной ДНК проведите электрофорез на том же буфере при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут при напряжении 25 вольт и 250 миллиамперах.
По окончании электрофореза нейтрализуйте образцы на предметных стеклах, добавив два миллилитра трисового раствора соляной кислоты три раза в течение пяти минут. Поместите образцы в 100-миллилитровые банки с коплином, содержащие 95% спирта при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы обезвоживать образцы. Окрасьте образцы, добавив 10 микролитров DAPI в центр предметного стекла.
Затем распределите краситель по всем образцам с помощью покровного стекла. Изучите предметные стекла под флуоресцентным фотомикроскопом с NU-фильтром. Количественно оцените повреждение ДНК, оценив продолжительность миграции ДНК из нуклеоида.
В этом случае визуально определите его по 100 случайно выбранным ячейкам без перекрытия. Затем классифицируйте повреждения ДНК на четыре класса, где от нуля до одного означает отсутствие повреждений, два — минимальный ущерб, три — средний урон и четыре — максимальный урон. Выразите данные в виде среднего числа поврежденных клеток и среднего балла кометы для каждой группы лечения.
Наконец, на основе этих данных рассчитайте индекс генетического повреждения или GDI для каждого тестируемого организма, используя уравнение, показанное на экране. На этом рисунке показан масштабный индекс массы взрослых особей Boana pulchella и Leptodactylus luctator. Для анализа масштабного индекса массы был проведен нелинейный регрессионный анализ, который демонстрирует степенную зависимость между SVL и массой тела для вида для определения масштабной экспоненты.
Масштабный индекс массы полезен для сравнения групп взрослых или молодых особей одного вида. Здесь представлены гистологические срезы печени Boana raniceps. По этим срезам можно наблюдать большее количество c и большие размеры гепатоцитов и ядра гепатоцитов.
На рисунке показаны различные и взаимодополняющие реакции цитогенетических биомаркеров при воздействии гербицидов на Boana pulchella. Здесь черные полосы указывают на 48 часов, а серые полосы — на 96 часов. Время воздействия и концентрация всегда должны рассматриваться в качестве фактора, поскольку конкретного времени или концентрации может быть недостаточно для причинения вреда.
Репрезентативное изображение описывает, как биомаркеры связаны с индексом ответа на биомаркеры. Здесь синим цветом обозначена контрольная группа, а оранжевым, желтым и зеленым цветами обозначены сценарии воздействия BDE-209. Эти данные указывают на то, что каталаза является эффективным биомаркером для стрессовых ситуаций, в которых стрессор присутствует в самых высоких концентрациях.
При расчете индекса упитанности последовательно делайте фотографии с одного и того же расстояния. У головастиков измерьте длину тела SVL до клоакальной трубки, исключая хомутный плавник. Этот подход безопасно учитывает физиологию амфибий и влияние изменений окружающей среды.
Несмотря на то, что существуют альтернативные потенциально инвазивные биомаркеры, эти методы позволяют получить представление об окислительном стрессе, токсикодинамике и токсикогенетике. Дополнительные измерения ферментов, связанные с окислительным стрессом, могут служить альтернативными методологиями. Метод анализа цветовых различий оценивает реакцию тканей на микрофотографиях на основе цветовых диспропорций.
Для пигментной системы убедитесь, что калибровка программы совпадает с микрофотографией. Этот передовой метод играет важную роль в исследовании того, влияют ли ксенобиотики непосредственно на ДНК в различных типах клеток, решая вопросы, касающиеся окислительного повреждения генетического материала и процессов репарации, которые другие цитогенетические методы не могут решить.
