בעוד שהטכניקות להערכת סמנים ביולוגיים ביוכימיים נמצאות בשימוש נרחב, פרוטוקול זה מציג פרטים חיוניים לסטנדרטיזציה ושכפול של המתודולוגיה באנורים ניאוטרופיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא העלות הנמוכה שלה, שכפול, ואת היישום שלה. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי לקבל נתונים כמותיים כדי להעריך שינויים במלנין הפנימי.
בדיקת השביט היא טכניקה רגישה, רב-תכליתית ופשוטה המאפשרת לקבוע השפעות גנוטוקסיות המושרות על ידי תרכובת מסוימת. זה יכול להיות מיושם על כל סוג של תאים אאוקריוטים כדי לפקח על נזק DNA, תיקון DNA, ולהעריך את המצב נוגד חמצון של תאים. כדי להתחיל, פתח את התוכנה Image-Pro Plus 6.0 ובחר תפריט וסרגל כלים כמו ביולוגי.
כדי לכמת את השטח שנכבש על ידי מלנין, בחר מידה ולאחר מכן בחר את הכיול המרחבי של ההגדלה המשמש לצילום המיקרוגרפים של התמונות. לאחר פתיחת התמונה ההיסטולוגית, בחרו 'ספירת כלים' ולאחר מכן מדדו עצמים. סמנו את הצביעה שתימדד בתמונה בעזרת הכלי בחירת צבעים וטפטפת ולאחר מכן סגרו את החלון.
הצג את התוצאות באופן חזותי על-ידי לחיצה על ספירה, תצוגה וסטטיסטיקה. דגרו על תערובת של PBS, מי חמצן ודגימה בקובט קוורץ של שלושה מיליליטר באורך נתיב של סנטימטר אחד. לאחר מכן הסר את הדגימה שנשמרה בצינור צנטריפוגה של 500 מיקרוליטר והוסף אותה לקובט הקוורץ.
קרא את קינטיקה קטלאז ב 240 ננומטר במשך שתי דקות בספקטרופוטומטר UV וחשב את פעילות האנזים באמצעות המשוואה המוצגת על המסך. לדלל את דגימת הדם שנאספה עם מיליליטר אחד של PBS. צנטריפוגר אותו ב 381 G במשך תשע דקות, ולהשעות מחדש את הגלולה עם 50 מיליליטר של PBS.
ערבבו 30 מיקרוליטר של דגימת הדם ב-70 מיקרוליטר של אגרוז או LMPA בריכוז של 0.5% של אגרוז ליצירת שכבה שתיים. מניחים 50 מיקרוליטר של שכבה שתיים על שקופית שצופתה בעבר בשכבה אחת המכילה 100 מיקרוליטר של 0.5% נקודת התכה רגילה אגרוז. מכסים את המגלשה בכיסוי ומניחים אותה בקור בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי למצק את השכבה השנייה.
לאחר המיצוק, הסירו את הכיסוי. יוצרים את השכבה השלישית על ידי הנחת 100 מיקרוליטר של 0.5% LMPA ומכסים שוב את המגלשה. לאחר שהשכבה השלישית מתמצקת, מסירים את הכיסוי וטובלים כל שקופית בצנצנת קופלין 100 מיליליטר המכילה את תמיסת הליזיס שהוכנה באותו היום.
הניחו את צנצנות הקופלין באמבטיה קרה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת בחושך כדי שהליזה תתרחש. בסוף הליזיס, הסר את המגלשות וטבול אותן בתמיסת חיץ האלקטרופורזה במיכל האלקטרופורזה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לדנ"א להירגע. לאחר שחרור הדנ"א הגרעיני, בצעו אלקטרופורזה על אותו חיץ בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במתח של 25 וולט ו-250 מיליאמפר.
בסוף האלקטרופורזה, נטרלו את הדגימות בשקופיות על ידי הוספת שני מיליליטרים של תמיסת טריס הידרוכלורית שלוש פעמים במשך חמש דקות. הניחו את הדגימות בצנצנות קופלין 100 מיליליטר המכילות 95% אלכוהול בארבע מעלות צלזיוס כדי לייבש את הדגימות. הכתימו את הדגימות על ידי הוספת 10 מיקרוליטר DAPI למרכז השקופית.
לאחר מכן מורחים את הצבע לאורך הדגימות בעזרת כיסוי. בחנו את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן NU. כמת את הנזק לדנ"א על ידי הערכת משך נדידת הדנ"א מהנוקליאואיד.
במקרה זה, לקבוע חזותית את זה על 100 תאים שנבחרו באופן אקראי ללא חפיפה. לאחר מכן סווגו את הנזק לדנ"א לארבע מחלקות כאשר אפס לאחד הוא ללא נזק, שניים הוא עבור נזק מינימלי, שלושה הוא עבור נזק בינוני, וארבעה הוא עבור נזק מקסימלי. בטא את הנתונים כמספר הממוצע של תאים פגומים ואת ציון השביט הממוצע עבור כל קבוצת טיפול.
לבסוף, מתוך נתונים אלה, חשב את מדד הנזק הגנטי או GDI עבור כל אורגניזם בדיקה באמצעות המשוואה המוצגת על המסך. מדד המסה בקנה מידה של מבוגרים Boana pulchella ו- Leptodactylus luctator מוצג באיור זה. לצורך ניתוח מדד המסה המתוקנת, בוצע ניתוח רגרסיה לא ליניארית המדגים את יחסי פונקציית הכוח בין SVL למסת הגוף עבור המין כדי לקבוע את מעריך קנה המידה.
מדד המסה המוקטן שימושי להשוואה בין קבוצות של בוגרים או צעירים מאותו מין. החלקים ההיסטולוגיים של הכבד של Boana raniceps מוצגים כאן. כמות גדולה יותר של c וממדים גדולים יותר של hepatocyte ואת הגרעין של hepatocytes ניתן לראות מקטעים אלה.
תגובות שונות ומשלימות של סמנים ביולוגיים ציטוגנטיים בחשיפה לקוטלי עשבים ב- Boana pulchella מוצגות באיור זה. כאן, הפסים השחורים מציינים 48 שעות, והעמודות האפורות מציינים 96 שעות. זמן החשיפה והריכוז צריכים תמיד להיחשב כגורם כאן, שכן זמן או ריכוז מסוים עשויים שלא להספיק כדי לגרום נזק.
התמונה המייצגת מתארת כיצד הסמנים הביולוגיים קשורים למדד התגובה של הסמן הביולוגי. כאן, הכחול מציין את קבוצת הביקורת, ואילו הצבעים כתום, צהוב וירוק מציינים את תרחישי החשיפה ל- BDE 209. נתונים אלה מצביעים על כך שקטלאז הוא סמן ביולוגי יעיל למצבי לחץ שבהם גורם הלחץ נמצא בריכוזים הגבוהים ביותר.
בעת חישוב מדד מצב הגוף, צלם באופן עקבי מאותו מרחק. בראשנים, מדדו את אורך גוף SVL עד לצינור הקלואקל, למעט סנפיר הצווארון. גישה זו מתייחסת בבטחה לפיזיולוגיה של הדו-חיים ולהשפעת השינויים הסביבתיים.
בעוד שקיימים סמנים ביולוגיים חלופיים שעלולים להיות פולשניים, שיטות אלה מציעות תובנות לגבי עקה חמצונית, טוקסיקודינמיקה וטוקסיקוגנטיקה. מדידות אנזימים נוספות הקשורות לעקה חמצונית יכולות לשמש כמתודולוגיות חלופיות. טכניקת ניתוח הבדלי הצבעים מעריכה תגובות רקמות בפוטומיקרוגרפים בהתבסס על פערי צבעים.
עבור המערכת הפיגמנטרית, ודא שכיול התוכנית מיושר עם הפוטומיקרוגרף. טכניקה מתקדמת זו מסייעת לחקור אם קסנוביוטיקה משפיעה ישירות על דנ"א בסוגי תאים שונים, ולענות על שאלות בנוגע לנזק חמצוני של חומר גנטי ותהליכי תיקון שטכניקות ציטוגנטיות אחרות אינן מסוגלות לטפל בהן.
