Embora as técnicas de avaliação de biomarcadores bioquímicos sejam amplamente utilizadas, este protocolo apresenta detalhes cruciais para padronizar e replicar a metodologia em anuros neotropicais. A principal vantagem dessa técnica é seu baixo custo, replicabilidade e sua aplicação. Esta técnica pode ser aplicada para obter dados quantitativos para avaliar alterações na melanina interna.
O ensaio cometa é uma técnica sensível, versátil e simples que permite a determinação dos efeitos genotóxicos induzidos por um composto específico. Pode ser aplicado a qualquer tipo de células eucarióticas para monitorar danos ao DNA, reparo do DNA e avaliar o status antioxidante das células. Para começar, abra o software Image-Pro Plus 6.0 e selecione menu e barra de ferramentas como biológico.
Para quantificar a área ocupada pela melanina, selecione medir e, em seguida, selecione a calibração espacial da ampliação usada para tirar as micrografias fotográficas. Depois de abrir a imagem histológica, selecione a contagem de ferramentas e, em seguida, meça os objetos. Marque a coloração a ser medida na imagem usando a ferramenta selecionar cores e conta-gotas e feche a janela.
Visualize os resultados clicando em contagem, visualização e estatísticas. Incube uma mistura de PBS, peróxido de hidrogênio e uma amostra em uma cubeta de quartzo de três mililitros com um comprimento de caminho de um centímetro. Em seguida, remova a amostra mantida em um tubo de centrífuga de 500 microlitros e adicione-a à cubeta de quartzo.
Leia a cinética da catalase a 240 nanômetros por dois minutos em um espectrofotômetro UV e calcule a atividade enzimática usando a equação mostrada na tela. Diluir a amostra de sangue coletada com um mililitro de PBS. Centrifugue-o a 381 G por nove minutos e ressuspenda o pellet com 50 mililitros de PBS.
Misture 30 microlitros da amostra de sangue em 70 microlitros de agarose de baixo ponto de fusão ou LMPA a uma concentração de 0,5% de agarose para formar a camada dois. Coloque 50 microlitros da camada dois em uma lâmina previamente revestida com a camada um contendo 100 microlitros de agarose de ponto de fusão normal a 0,5%. Cubra a lâmina com uma lamínula e coloque-a no frio a quatro graus Celsius por 10 minutos para solidificar a camada dois.
Após a solidificação, remova a lamínula. Forme a terceira camada colocando 100 microlitros de 0,5% LMPA e cubra a lâmina novamente. Depois que a terceira camada solidificar, remova a lamínula e mergulhe cada lâmina em um frasco de coplin de 100 mililitros contendo a solução de lise preparada no mesmo dia.
Coloque os frascos de coplin em um banho frio a quatro graus Celsius por uma hora no escuro para que ocorra a lise. No final da lise, remova as lâminas e mergulhe-as na solução tampão de eletroforese no tanque de eletroforese por 15 minutos a quatro graus Celsius para permitir que o DNA se desenrole. Após o desenrolamento do DNA nuclear, realize eletroforese no mesmo tampão a quatro graus Celsius por 10 minutos a 25 volts e 250 miliamperes.
No final da eletroforese, neutralizar as amostras nas lâminas adicionando três vezes dois mililitros de solução tris-clorídrica durante cinco minutos. Coloque as amostras em potes de coplin de 100 mililitros contendo 95% de álcool a quatro graus Celsius para desidratar as amostras. Pinte as amostras adicionando 10 microlitros de DAPI ao centro da lâmina.
Em seguida, espalhe o corante pelas amostras com uma lamínula. Examinar as lâminas num fotomicroscópio de fluorescência com um filtro NU. Quantifique o dano ao DNA avaliando a duração da migração do DNA do nucleóide.
Nesse caso, determine-o visualmente em 100 células selecionadas aleatoriamente sem sobreposição. Em seguida, classifique o dano de DNA em quatro classes, onde zero a um é para nenhum dano, dois é para dano mínimo, três é para dano médio e quatro é para dano máximo. Expresse os dados como o número médio de células danificadas e a pontuação média do cometa para cada grupo de tratamento.
Por fim, a partir desses dados, calcule o índice de dano genético ou GDI para cada organismo de teste usando a equação mostrada na tela. O índice de massa em escala de adultos de Boana pulchella e Leptodactylus luctator é mostrado nesta figura. Para a análise do índice de massa escalonado, foi realizada uma análise de regressão não linear que demonstra a relação da função de potência entre o CRC e a massa corporal para a espécie para determinar o expoente de escala.
O índice de massa em escala é útil para comparar grupos de adultos ou juvenis da mesma espécie. Os cortes histológicos do fígado de Boana raniceps são apresentados aqui. A partir desses cortes, observa-se maior quantidade de c e maiores dimensões do hepatócito e do núcleo dos hepatócitos.
Respostas diferentes e complementares de biomarcadores citogenéticos em um cenário de exposição a herbicidas em Boana pulchella são mostradas nesta figura. Aqui, as barras pretas indicam 48 horas e as barras cinzas indicam 96 horas. O tempo de exposição e a concentração devem ser sempre considerados como um fator aqui, uma vez que um determinado tempo ou concentração pode não ser suficiente para induzir danos.
A imagem representativa descreve como os biomarcadores estão relacionados ao índice de resposta do biomarcador. Aqui, o azul indica o grupo controle, enquanto as cores laranja, amarelo e verde indicam os cenários de exposição ao BDE 209. Esses dados indicam que a catalase é um biomarcador eficaz para situações de estresse nas quais o estressor está presente nas concentrações mais altas.
Ao calcular o índice de condição corporal, tire fotos consistentemente da mesma distância. Em girinos, medir o comprimento do corpo do SVL até o tubo cloacal, excluindo a barbatana do colarinho. Esta abordagem aborda com segurança a fisiologia dos anfíbios e o impacto das alterações ambientais.
Embora existam biomarcadores alternativos potencialmente invasivos, esses métodos oferecem informações sobre estresse oxidativo, toxicodinâmica e toxicogenética. Medições enzimáticas adicionais relacionadas ao estresse oxidativo podem servir como metodologias alternativas. A técnica de análise de diferença de cor avalia as respostas teciduais em fotomicrografias com base nas disparidades de cor.
Para o sistema pigmentar, certifique-se de que a calibração do programa esteja alinhada com a fotomicrografia. Esta técnica avançada é fundamental para investigar se os xenobióticos afetam diretamente o DNA em diversos tipos de células, abordando questões relacionadas a danos oxidativos de material genético e processos de reparo que outras técnicas citogenéticas não conseguem abordar.
