Sebbene le tecniche per la valutazione dei biomarcatori biochimici siano ampiamente utilizzate, questo protocollo presenta dettagli cruciali per standardizzare e replicare la metodologia negli anuri neotropicali. Il vantaggio principale di questa tecnica è il suo basso costo, la replicabilità e la sua applicazione. Questa tecnica può essere applicata per ottenere dati quantitativi per valutare le alterazioni della melanina interna.
Il saggio della cometa è una tecnica sensibile, versatile e semplice che consente di determinare gli effetti genotossici indotti da un composto specifico. Può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula eucariotica per monitorare il danno al DNA, la riparazione del DNA e valutare lo stato antiossidante delle cellule. Per iniziare, apri il software Image-Pro Plus 6.0 e seleziona il menu e la barra degli strumenti come biologico.
Per quantificare l'area occupata dalla melanina, selezionare misura, quindi selezionare la calibrazione spaziale dell'ingrandimento utilizzata per scattare le micrografie fotografiche. Dopo aver aperto l'immagine istologica, selezionare il conteggio degli strumenti e quindi misurare gli oggetti. Contrassegnare la colorazione da misurare nell'immagine utilizzando lo strumento Seleziona colori e contagocce, quindi chiudere la finestra.
Visualizza i risultati facendo clic su conteggio, visualizzazione e statistiche. Incubare una miscela di PBS, perossido di idrogeno e un campione in una cuvetta di quarzo da tre millilitri con una lunghezza di percorso di un centimetro. Quindi rimuovere il campione conservato in una provetta da centrifuga da 500 microlitri e aggiungerlo alla cuvetta di quarzo.
Leggere la cinetica della catalasi a 240 nanometri per due minuti in uno spettrofotometro UV e calcolare l'attività enzimatica utilizzando l'equazione mostrata sullo schermo. Diluire il campione di sangue raccolto con un millilitro di PBS. Centrifugare a 381 G per nove minuti e risospendere il pellet con 50 millilitri di PBS.
Mescolare 30 microlitri di campione di sangue in 70 microlitri di agarosio a basso punto di fusione o LMPA a una concentrazione dello 0,5% di agarosio per formare il secondo strato. Posizionare 50 microlitri di strato due su un vetrino precedentemente rivestito con lo strato uno contenente 100 microlitri di agarosio con punto di fusione normale allo 0,5%. Coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti e metterlo al freddo a quattro gradi Celsius per 10 minuti per solidificare lo strato due.
Dopo la solidificazione, rimuovere il vetrino coprioggetti. Formare il terzo strato stendendo 100 microlitri di LMPA allo 0,5% e coprire nuovamente il vetrino. Dopo che il terzo strato si è solidificato, rimuovere il vetrino coprioggetti e immergere ogni vetrino in un barattolo di coplin da 100 millilitri contenente la soluzione di lisi preparata lo stesso giorno.
Metti i barattoli di coplin in un bagno freddo a quattro gradi Celsius per un'ora al buio affinché avvenga la lisi. Al termine della lisi, rimuovere i vetrini e immergerli nella soluzione tampone per elettroforesi nella vasca per elettroforesi per 15 minuti a quattro gradi Celsius per consentire al DNA di svolgersi. Dopo lo svolgimento del DNA nucleare, eseguire l'elettroforesi sullo stesso tampone a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 25 volt e 250 milliampere.
Al termine dell'elettroforesi, neutralizzare i campioni nei vetrini aggiungendo due millilitri di soluzione tricrilica tre volte per cinque minuti. Mettere i campioni in barattoli di coplin da 100 millilitri contenenti il 95% di alcol a quattro gradi Celsius per disidratare i campioni. Colorare i campioni aggiungendo 10 microlitri di DAPI al centro del vetrino.
Quindi stendere il colorante su tutti i campioni con un vetrino coprioggetti. Esaminare i vetrini con un fotomicroscopio a fluorescenza con un filtro NU. Quantificare il danno al DNA valutando la lunghezza della migrazione del DNA dal nucleoide.
In questo caso, determinalo visivamente su 100 celle selezionate casualmente senza sovrapposizioni. Quindi classifica il danno al DNA in quattro classi: da zero a uno è per nessun danno, due è per il danno minimo, tre è per il danno medio e quattro è per il danno massimo. Esprimere i dati come il numero medio di cellule danneggiate e il punteggio medio della cometa per ciascun gruppo di trattamento.
Infine, da questi dati, calcolare l'indice di danno genetico o GDI per ciascun organismo in esame utilizzando l'equazione mostrata sullo schermo. L'indice di massa in scala degli adulti di Boana pulchella e Leptodactylus luctator è mostrato in questa figura. Per l'analisi dell'indice di massa scalabile, è stata eseguita un'analisi di regressione non lineare che dimostra la relazione della funzione di potenza tra l'SVL e la massa corporea per la specie per determinare l'esponente di scala.
L'indice di massa in scala è utile per confrontare gruppi di adulti o giovani della stessa specie. Qui vengono presentate le sezioni istologiche del fegato di Boana raniceps. Da queste sezioni si può osservare una maggiore quantità di c e maggiori dimensioni dell'epatocita e del nucleo degli epatociti.
In questa figura sono mostrate risposte diverse e complementari di biomarcatori citogenetici in uno scenario di esposizione ad erbicidi in Boana pulchella. Qui, le barre nere indicano 48 ore e le barre grigie indicano 96 ore. Il tempo di esposizione e la concentrazione dovrebbero sempre essere considerati un fattore in questo caso, poiché un particolare tempo o concentrazione potrebbe non essere sufficiente per indurre il danno.
L'immagine rappresentativa descrive come i biomarcatori sono correlati all'indice di risposta del biomarcatore. Qui, il blu indica il gruppo di controllo, mentre i colori arancione, giallo e verde indicano gli scenari di esposizione alla BDE 209. Questi dati indicano che la catalasi è un biomarcatore efficace per le situazioni di stress in cui il fattore di stress è presente alle concentrazioni più elevate.
Quando si calcola l'indice di condizione corporea, scattare sempre fotografie dalla stessa distanza. Nei girini, misurare la lunghezza del corpo SVL fino al tubo cloacale, esclusa la pinna del colletto. Questo approccio affronta in modo sicuro la fisiologia degli anfibi e l'impatto dei cambiamenti ambientali.
Sebbene esistano biomarcatori alternativi potenzialmente invasivi, questi metodi offrono approfondimenti sullo stress ossidativo, sulla tossicodinamica e sulla tossicogenetica. Ulteriori misurazioni enzimatiche relative allo stress ossidativo possono servire come metodologie alternative. La tecnica di analisi della differenza di colore valuta le risposte tissutali nelle fotomicrografie in base alle disparità di colore.
Per il sistema pigmentario, assicurarsi che la calibrazione del programma sia allineata con la micrografia fotografica. Questa tecnica avanzata è fondamentale per indagare se gli xenobiotici influenzano direttamente il DNA in diversi tipi di cellule, rispondendo a domande riguardanti il materiale genetico, il danno ossidativo e i processi di riparazione che altre tecniche citogenetiche non sono in grado di affrontare.
