リケッチア遺伝子の機能的研究は、病因におけるそれらの役割を理解するために重要であるため、制御された方法で遺伝子を変更する信頼できる方法が必要です。私たちのプロトコルは、エレクトロポレーションを使用して、リケッチア属の偏性細胞内細菌に外因性DNAを導入し、導入されたDNAの影響を研究することを可能にします。今日、私と一緒に手順を実演するのは、マンダーロー博士とクルッティ博士の研究室の研究者であるリサ・プライスです。
まず、本文に記載されているように、90〜100%リケッチアパーケリ感染ISE6細胞培養を準備します。次に、ギムザ染色により感染率を決定し、細胞懸濁液を完全培地で1:5の比率に希釈し、113Gで5分間遠心分離することにより、100マイクロリットルの細胞懸濁液をガラス顕微鏡スライド上に堆積させた。スライドを風乾させた後、室温で5分間無水メタノールに固定します。
次に、スライドとギムザ染色を摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、スライドを水ですすぎ、乾いたら、オイル対物レンズを備えた光学顕微鏡で表示します。感染細胞と非感染細胞をカウントすることにより、感染細胞の割合を決定します。
無細胞リケッチアパーケリを調製するには、約0.2ミリリットルの滅菌60〜90炭化ケイ素グリットを2つの2ミリリットルの滅菌マイクロ遠心チューブに注ぎ、チューブを脇に置きます。5ミリリットルの培地が入ったリケッチア・パーケリ感染フラスコから、細胞層を乱さないように注意しながら2ミリリットルの培地を取り出す。次に、残りの3ミリリットルの培地で細胞を再懸濁します。
この懸濁液を2つの準備された炭化ケイ素グリットチューブの間で均等に分割し、チューブを高速で30秒間ボルテックスします。次に、それらを氷の上に置きます。次に、プランジャーを伸ばして滅菌5ミリリットルルアーロックシリンジを準備し、15ミリリットルの円錐管を保持するために使用されるポリスチレンベースにプランジャー端を挿入します。
ゴム球で操作したバリア2ミリリットルのパスツールピペットを使用して、グリットを吸引せずに渦細胞の上清を慎重に除去します。次に、ピペットチップをシリンジハブの開口部に挿入し、穏やかな圧力で内容物をシリンジに排出します。次に、シリンジハブに取り付けられた滅菌2マイクロメートルの孔径フィルターを通して、リケッチアパーケリ培養物を滅菌1.5ミリリットルのチューブにろ過し、チューブを13, 600 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。
上清を除去した後、細胞ペレットを1.2ミリリットルの300ミリモルの氷冷スクロース溶液で2回洗浄する。サンプルを遠心分離し、洗浄の合間に上清を除去します。遠心分離の最後に、プールした細胞ペレットを100〜150マイクロリットルの氷冷スクロース溶液でそれぞれ2〜3個の形質転換サンプルに再懸濁します。
次に、サンプルを事前に冷却された滅菌済みの1.5マイクロリットルのマイクロ遠心チューブで50マイクロリットルのアリコートに分割します。3マイクログラムのエンドトキシンフリーpRAM18sSFAプラスミドDNAを50マイクロリットルのリケッチアパーケリを含む各チューブに氷上で形質転換し、ピペットチップで穏やかに攪拌します。混合物を、0.1センチメートルのギャップサイズを有する予め冷却された滅菌エレクトロポレーションキュベットに移す。
キュベットを軽くたたいて混合物を均等に分配し、氷上で10〜30分間インキュベートします。その間、完全にコンフルエントなISE6細胞培養フラスコから培地を取り出し、重炭酸ナトリウムとHEPESバッファーを含む1.5ミリリットルの新鮮な培地で細胞を穏やかにすすぎ、細胞層を再懸濁します。均質な細胞懸濁液を生成した後、全容量を単一の滅菌2ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。
次に、リケッチア・パーケリとプラスミドDNA混合物をエレクトロポレーターを用いてエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後、滅菌拡張チップピペットを使用して少量のISE6細胞懸濁液をキュベットに移し、ゆっくりと上下にピペットでピペットしてエレクトロポレーションされたリケッチアパーケリを回収します。次いで、キュベットの内容物を、残りのISE6細胞懸濁液を含む2ミリリットルのチューブに移す。
次に、サンプルを室温で遠心分離し、最初に700 Gで2分間遠心分離してISE6細胞を引き下げ、次に13, 600 Gで1分間遠心分離してリケッチアを引き下げます。チューブを摂氏34度で15分から1時間インキュベートします。インキュベーション後、1つの形質転換の再懸濁内容物を、重炭酸ナトリウムとHEPESバッファーを含む3.5ミリリットルの新鮮な培地を含む1つの25平方センチメートルの細胞培養フラスコに移します。
フラスコを揺り動かして混合物を均等に広げ、摂氏34度でインキュベートします。16〜24時間後、スペクチノマイシンとストレプトマイシンをそれぞれ10マイクロリットルインキュベートしたフラスコに加えます。フラスコを揺り動かして抗生物質を培地に均一に混合してから、フラスコをインキュベーターに戻します。
野生型リケッチア・パーケリおよびISE6細胞の増殖の成功は、ギムザ染色によって明らかであった。細胞内および細胞外のリケッチでギムザで濃い紫色に染色されたISE6細胞の核が見えます。ISE6細胞において赤色蛍光タンパク質を発現するリケッチア・パーケリの形質転換は、7日間のインキュベーション後に共焦点顕微鏡により確認した。
10日後に感染率の大幅な増加が観察された。手順全体を通して、すべてを無菌状態に保ちます。リケッチアのいくつかの種、特に成長の遅い内部共生生物は形質転換に長い時間がかかるので、細部に注意を払い、辛抱してください。
このプロトコルにより、リケッチア生物学の複数の側面と、節足動物ベクターおよび哺乳類宿主との相互作用の研究が可能になりました。例えば、蛍光タンパク質発現リケッチは、ダニ細胞の運動性および共生細胞相互作用を追跡するために使用されている。
