私たちのプロトコルは、長期的なオルガノイドの維持に効果的であることが証明されているいくつかの技術を組み合わせたものです。これは、臨床症状が発達期外である加齢性疾患の老化を研究するのに役立ちます。この技術の主な利点は、特殊な機器や試薬を必要としないことです。
これは、ラボで一般的に見られる材料に大きく基づいています。加齢および神経変性疾患は、現在のモデリング手法が発達初期ではなく確立された疾患表現型に主に焦点を当てているため、特に興味深いポイントになっています。胚性幹細胞やiPS細胞は非常にデリケートな細胞です。
初めてのユーザーは優しく、忍耐力を持っている必要があります。これらは長期培養であるため、最初から辛抱強く待つ必要があります まず、縫合糸に70%エタノールをスプレーし、メスの鈍い端で縫合糸をほつれさせてPLGAマイクロフィラメントを準備します。ファイバーを顕微鏡下に置きます。
そして定規を使用して、繊維を500マイクロメートルから1ミリメートルの長さのストランドの断片に切断し始めます。合計で約25ミリメートルの繊維を切り取り、1ミリリットルの抗生物質 - 抗真菌溶液を含む15ミリリットルのチューブにフィラメントを追加します。次にフードで、繊維溶液を10ミリリットルのDMEM / F-12とボルテックスで希釈してよく混ぜます。
次に、20マイクロリットルのファイバー溶液を96ウェルプレートの3つのウェルに追加します。明視野顕微鏡を使用して、ウェルあたりの繊維を数えて平均します。ウェルを繊維溶液で希釈または濃縮して、ウェルあたり平均5〜10マイクロフィラメントにします。
以前に培養した人工多能性幹細胞が70〜80%コンフルエントに達したら、顕微鏡で細胞を10倍または20倍の倍率で確認します。コロニーが自発的分化の面積を10%未満表示していることを確認します。培地をピペットで吸引し、DPBSで細胞を1回洗浄します。
次に、500マイクロリットルの細胞剥離溶液または0.5ミリモルのEDTAを加えてコロニーを解離し、摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。次に、1ミリリットルの新鮮なE8培地を各ウェルに加え、ピペットで静かにピペットですべての細胞を剥離します。細胞懸濁液全体を15ミリリットルの遠沈管に移し、さらに1ミリリットルの新鮮なE8培地を加えます。
次に、細胞を290gで室温で3分間スピンダウンします。上清を廃棄した後、50マイクロモルのROCK阻害剤を添加した1ミリリットルのE6培地に細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞をカウントする。ROCK阻害剤を添加したE6培地中で所望の着座密度の細胞懸濁液を調製する。
次に、150マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェル超低アタッチメントプレートの各ウェルに追加します。次に、プレートを290gで室温で3分間遠心分離し、細胞を強制的に凝集させます。次に、プレートを加湿雰囲気中で摂氏37度でインキュベートし、胚様体形成のために5%二酸化炭素を使用します。
24時間のインキュベーション後、プレートをフードに移し、ピペットチップをウェル内に下げすぎて胚様体を吸引しないように注意しながら、ピペットを使用して120マイクロリットルの培地を注意深く吸引します。次に、2マイクロモルのXAV939を添加した150マイクロリットルの新鮮なE6培地とSMAD阻害剤を各ウェルに加えます。プレートをインキュベーターに戻し、培地をインヒビターを添加した新たに調製したE6と毎日交換します。
インキュベーションの7日目に、すべての胚様体が550〜600マイクロメートルの直径に達し、滑らかで明確なエッジを表示するかどうかを確認します。この段階で、それらは細胞外マトリックスに埋め込まれる準備ができています。オルガノイドを埋め込むには、空のP200ボックスの上に4インチの長さの熱可塑性天井フィルムシートを置き、ディンプル埋め込みシートを準備します。
次に、15ミリリットルの円錐管または500マイクロリットルのマイクロ遠心管を使用し、フィルムシートを穴にそっと押し下げて、12個または必要な数のディンプルを作成します。次に、フィルムシートに70%エタノールをスプレーし、UVライトを点灯した状態でフード内で30分以上乾燥させます。その間、十分な量の基底膜マトリックスを氷上で解凍します。
次いで、広口径P200チップを用いて、1つの胚様体を96ウェルプレートから各ディンプルに移す。通常のピペットチップでできるだけ多くの培地を取り除きますが、胚様体を乾燥させないでください。次に、定期的にプレチルドしたP200チップを使用して、約30マイクロリットルの未希釈メンブレンマトリックスを各オルガノイドに追加し、胚体が液滴の中心にできるだけ近づくようにします。
すべての胚様体がマトリックスに埋め込まれたら、フィルムシートを滅菌ペトリ皿に入れます。次に、ペトリ皿を摂氏37度で10%の二酸化炭素を含む加湿雰囲気で5分間インキュベートして、膜マトリックスを固化させます。オルガノイド分化のために、ビタミンAを含まないB-27を含む5ミリリットルの調製分化培地を超低付着6ウェルプレートの1ウェルに加える。
インキュベーターでプレートを摂氏37度に予熱します。メンブレンマトリックスが固まったら、フィルムシートの背面からディンプルを押し出して、埋め込まれた胚様体を6ウェルプレートに移します。必要に応じて、ウェルから1ミリリットルの培地を使用し、それをシート上にピップしてフィルムシートから液滴を剥離します。
膜マトリックスに埋め込まれた胚様体は、in vitroで日ごとに明確な出芽形成を示す脳オルガノイドに向かって分化しました10。in vitro 30日目に、オルガノイドは、ディンプルまたはサンドイッチ包埋のいずれかを使用してさらに成熟される。長期培養は、脳オルガノイドが有意なサイズに成長したことを示しています。
in vitro 7日目に、胚様体はSOX2陽性の神経ロゼット、散在する未熟ニューロン、および神経前駆細胞を示します。一方、in vitroでは120日目までに、MAP2やNeuNなどの成熟ニューロンマーカーを示します。これらの細胞骨格マーカーは、ダブルコルチンやシナプシンなどの他の有糸分裂後マーカーと組み合わせて使用 して、シナプス可塑性やその他の加齢に伴う衰退、および星状細胞やグリアなどの追加の脳組織を調べることができます。
組織のエッジが無傷のままであることを確認することが重要です。有害なせん断力を最小限に抑えるには、媒体やオルガノイドの埋め込みを変更しながら、配管をゆっくりと行う必要があります。オルガノイドの成長が遅いため、初期の細胞症状における疾患の進行を研究することができます。
オルガノイドの作成は、多くの病気の治療における早期発見への道を開きます。
