人工多能性幹細胞由来の造血子前遺伝子細胞をニューロンオルガノイドの誘導および発生プロセスに組み込むことにより、常在するミクログリアとニューロンを含むヒト脳オルガノイドを生成するプロトコルを提示します。この方法は、ヒトの脳発生におけるミクログリアとニューロンの相互作用を研究するためのモデルを提供します。3D脳オルガノイドは、人工多能性幹細胞またはiPS細胞から生成されたミニ脳です。
動物や人間の被験者に代わるものとして、脳の発達や神経障害の研究において、人間の脳を模倣するために広く使用されてきました。これらは、人間の健康研究を前進させるための優れたツールです。3Dヒト脳オルガノイドの従来のプロトコルでは、ニューロンとは異なる胚系統から生じるため、ヒト脳の常在免疫細胞であるミクログリアを生成することはめったにありません。
ミクログリアは分化の後の段階で脳オルガノイドに添加することができますが、ヒトの脳の発達をよりよく模倣する方法が必要です。他のほとんどのプロトコルでは、脳オルガノイド生成の最後にHPCまたはミクログリアが追加されます。神経誘導の前に、iPS細胞とHPCが混在した細胞から胚様体を作製します。
これは、ミクログリアの前駆体が発達の非常に早い段階で脳に移動するため、人間の脳の発達をよりよく模倣している可能性があります。さらに、HPCを使用すると、ミクログリアの分化プロトコルに30日以上かかることが多いため、全体的な分化時間を節約できます。したがって、当社のプロトコルは時間と試薬のコストを節約できます。
まず、1ミリリットルのE8 Flex培地が入った12ウェルプレートで、解離したヒト人工多能性幹細胞またはiPS細胞を培養し、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。翌日、顕微鏡でコロニーを確認し、ウェル内のすべてのフィールドをスキャンしてコロニーの数を数えます。培地を造血キットの1ミリリットルの培地Aと交換します。
プレートをインキュベーターに48時間戻します。3日目に、使用済み培地500マイクロリットルを新鮮な培地A500マイクロリットルと交換し、摂氏37度と二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。翌日、細胞の成長とiPS細胞コロニーからの分化を観察します。
培地を1ミリリットルの培地Bと交換し、顕微鏡下で細胞分化を監視し、500マイクロリットルの培地Bで半量の培地交換を隔日で6〜7日間行います。10日目に、正常な造血前駆細胞(HPC)の形態を持つ明るい単円形細胞が浮遊しているか、いくつかの緩い凝集体で平らな層細胞に緩く付着している様子を観察します。次に、1 ミリリットルのピペットチップで 3 回ピペッティングして、差別化されたすべての HPC を回収します。
細胞を15ミリリットルのチューブに移します。細胞懸濁液を300Gで5分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの培地Bに再懸濁し、細胞懸濁液20マイクロリットルを細胞計数チャンバーに加え、セルメーターを使用して細胞をカウントします。Medium Bを使用して細胞濃度を1ミリリットルあたり100万細胞に調整します.Medium.The serial dilution culture技術により、培地Aでの培養終了までに適切な数とサイズのiPS細胞コロニーが生成され、コロニーは有意な形態学的変化を示しました.培地Bで3日後、HPCの分化が観察され、均一な丸い細胞が出現しました。
10日目には、HPCは主に大きな破片のないコロニー状のクラスターを形成しました。ヒトiPS細胞と分化したHPCを収集した後、iPS細胞の培養物が80%のコンフルエント度に達していることを確認してください。500マイクロリットルの付着防止リンス液をマイクロウェルプレートの1ウェルに追加し、気泡の形成を最小限に抑えます。
プレートホルダーが取り付けられたスイングバケットローターで2、000Gで5分間プレートを回転させます。すすぎ液を完全に取り除き、気泡を発生させずに1ミリリットルのDPBSでウェルを2回洗浄し、次に1ミリリットルのDMEM / F-12で洗浄します。iPS細胞を1ミリリットルのACCUTASE溶液で処理し、細胞の解離を開始します。
顕微鏡で細胞を観察し、細胞が底部に付着したままの細胞分裂の兆候を観察します。ACCUTASE溶液を1ミリリットルのDMEM/F-12培地と交換し、次に上下に混合して細胞を単一細胞に解離します。解離した細胞を15ミリリットルのチューブに移し、DMEM/F-12培地を加えて最終容量5ミリリットルにします。
細胞を300Gで5分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのE8 Flex培地に再懸濁します。細胞をカウントして、E8 Flex培地中の細胞濃度を1ミリリットルあたり100万細胞に調整します。次に、iPS細胞とHPCを2対1の割合でマイクロウェル培養プレートのウェルに混合します。
上清に1ミリリットルの培地あたり1マイクロリットルのROCK阻害剤Y-27632ストック溶液を加え、プレートを左右に振ってください。.プレートを300Gで5分間回転させ、顕微鏡で観察して、細胞がマイクロウェルに落ち着いたことを確認します。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素とインキュベートします。
48時間後、顕微鏡で細胞を観察し、胚様体(EB)の形成を確認します。次に、24ウェル細胞培養プレートを500マイクロリットルの抗付着リンスバッファーで15分間処理し、低付着プレートを作成します。ウェルを1ミリリットルのDPBSで2回洗浄し、各ウェルに1ミリリットルのE8 Flex培地を追加します。
1ミリリットル幅のオリフィスピペットチップを使用して、EBをマイクロウェル培養プレートに再懸濁します。次に、低付着性24ウェルプレートの各ウェルについて、EBを含む培地を100マイクロリットル加えます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターで48時間インキュベートします。
まず、基底膜マトリックスのアリコートを氷上で30分間解凍します。EB形成後2日目に、事前に冷却した20マイクロリットルのピペットチップを使用して、培地の上に15マイクロリットルの氷冷基底膜マトリックスを小さな滴で追加してEBをコーティングします。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに48時間置きます。
EB形成後4日目に、EBを乱さずに500マイクロリットルの培地を慎重に取り除き、前に示したように基底膜マトリックスコーティングを繰り返します。次に、細胞の上に500マイクロリットルの多能性幹細胞神経誘導培地を追加します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%の細胞インキュベーターに入れます。
6日目と8日目に、500マイクロリットルの培地を500マイクロリットルの新鮮な神経誘導培地に慎重に交換することにより、半培地の変更を行います。10日目、12日目、14日目のインキュベーション後、神経幹細胞培地と半培地交換を行います。15日目に、ウェル含有球体を培地とともに、付着防止リンス溶液で処理した新しい12ウェルプレートに移します。
培養物の上に500マイクロリットルのニューロン成熟培地を追加します。成熟段階では、色の変化などの栄養素の枯渇の兆候がないか培地を監視します。栄養素の枯渇が観察された場合は、オルガノイドを6ウェルプレートに移します。
17日目に、ミクログリアの成熟を促進するために、成熟培地にサイトカインを6日間補給します。最後に、23日目に、得られた神経オルガノイドを収集して特性評価を行います。高品質のHPCとiPSCの混合物は、24時間以内にEBを形成し、継続的な増殖と最小限の破片を示しました。
新しいプレートに移した後、EBSは成熟培地のプラトーに達するまで成長し続けました。
