このプロトコルは、ACHIモデルでr-mTBI投与された動物から高品質の海馬横断スライスを製造するための明確な方法を提供します。ACHIモデルは軽傷を負います。頭蓋骨の骨折や出血、開頭術、または麻酔薬の使用は含まれていません。
さらに、安定した電気生理学的記録を可能にします。これらの技術は、病因が非常に不明なMTBIを繰り返した後のシナプス可塑性の変化の調査を可能にし、治療手段を知らせる可能性があります。手順を実演するのは、私の研究室の修士課程の学生であるアリソン・グロスとポスドクのエリック・エヨルフソン博士です。
ラットを拘束コーンに入れることから始め、鼻と鼻孔がコーンの小さな開口部の近くにあり、十分な換気ができるようにします。プラスチック製のヘアクリップで尾端のコーンを閉じて、ラットの動きを防ぎます。ヘルメットを拘束されたラットの正中線の上に手動で配置し、ターゲティングディスクを左頭頂葉の上に配置します。
次に、インパクターを手動で伸ばす位置に設定する前に、ラットをフォームパッドに置きます。インパクターの先端を手動で下げて、ヘルメットのターゲットディスクに接触させます。次に、インパクターを格納位置に設定して、インパクターをヘルメットの10ミリメートル上に引き出します。
脳定位固定装置アームのダイヤルを使用して、インパクトチップを10ミリメートル下げ、ヘルメットのターゲティングディスクに再度触れます。次に、動物の頭が毎秒6メートルで10ミリメートル急速に加速されるように、インパクトスイッチを切り替えます。デバイスがアクティブになったら、すぐに動物を拘束コーンから取り外して、即時の神経学的評価プロトコル(NAP)を実行します。
マウスを安楽死させた後、脳を解剖し、逆さまのペトリ皿の上の濡れたろ紙の上に置きます。鋭いメスを使用して、小脳と前頭前野を取り除き、脳を吸い取ります。脳の正中線を切り取って、2つの半球を分離します。
海馬横スライスを作成するには、片方の半球を内側面に置き、メスを内側に約30度傾け、脳の背側表面から薄いスライスを取り除き、ピストンに取り付けるための平らな面を提供します。脳を背側にひっくり返し、乾いたろ紙で脳組織をそっと軽くたたいて、余分なACSFを取り除きます。次に、シアノアクリレート接着剤を使用して脳の背側表面をピストンに取り付け、腹側表面を直立させます。
ピストンの外側のチューブを脳の上に伸ばし、脳が完全に覆われるまで液体アガロースをチューブに注ぎます。ピストンチューブに冷却ブロックをクランプして、アガロースをすばやく固化させます。ピストンをスライサーのチャンバーに配置し、チャンバーをネジで固定します。
ブレードを固定した後、氷冷した酸素化ACSFをスライサーチャンバーに追加します。スライサーで、切削速度を 4、オシレーションを 6 に設定し、連続シングルスライススイッチを [連続] に切り替えます。次に、スタートを押して、400マイクロメートルで脳の切片化を開始します。
スライサーが脳を切片化するときに、大口径のパスツールピペットを使用して、各スライスを酸素化ACSFの回復浴に移します。スライスを摂氏32度で30分間回復させ、次に室温でさらに30分間回復させます。これらの手順を繰り返して、2 番目の半球からスライスを作成します。
市販のマイクロピペットプーラーを使用して、外径1.5ミリメートル、内径1.1ミリメートルの10センチメートルのホウケイ酸ガラスキャピラリーから1〜2メガオームの記録電極を引き出します。パスツールピペットを使用して、海馬スライスを回収浴からカルボゲン化ACSFで灌流され、摂氏30度に維持されているチャンバーに移します。歯状回と顆粒細胞層が視野に見えるように脳スライスの向きを変えます。
正立顕微鏡を使用して、斜め光学系で歯状回を視覚化します。同心バイポーラ刺激電極を配置して、分子層の中央3分の1の内側穿孔経路(MPPファイバー)を活性化します。次いで、ACSFを充填したガラス製マイクロピペットをMPP内に配置した。
組織に触れると繊維が損傷するため、電極をさらに離して開始します。刺激電極と記録電極を配置したら、アンプ、デジタイザ、および記録ソフトウェアを使用して、誘発された電界応答を視覚化します。電流パルスで組織を刺激し、フィールドEPSPよりも小さい透明なファイバーボレーで0.7ミリボルトの最小振幅を確保することにより、適切なフィールド興奮性シナプス後電位(フィールドEPSP)を見つけます。
フィールドEPSPが最大振幅の70%になるまで、シミュレーション強度を増やして設定します。次に、0.067ヘルツで0.12ミリ秒のパルスを照射して、20分間安定したプレコンディショニングベースラインを確立します。安定したスライスの場合、fEPSPの初期傾きは変動性が10%未満で、プロットされたフィールドEPSPの傾きを通る最適適合線の傾きは0.5未満である必要があります。
ペアパルス刺激と刺激/応答入力/出力曲線の構築を使用して、基本的なシナプス特性の変化を決定します。ペアパルステストでは、0.033ヘルツで50ミリ秒のパルス間隔を持つ一連のペアパルスを適用します。入力/出力曲線では、0.033ヘルツで0.0ミリ秒から0.24ミリ秒までの一連の刺激強度の増加を適用して、フィールドEPSP応答サイズの変化をプロットします。
主にCB1受容体の活性化に依存する長期うつ病を研究するには、10ヘルツで6, 000パルスを使用します。ポストコンディショニング録音の場合は、0.067ヘルツの周波数で0.12ミリ秒のシングルパルス刺激を使用して、さらに60分間再開します。ポスト・コンディショニングの記録に続いて、ペアパルス刺激とそれに続く入出力曲線を管理します。
これらをベースライン記録と比較し、シナプス前放出特性の観察された変化と比較し、長期記録のスライスの健全性を評価します。.分析中は、シナプス前可塑性データセット内の個々のスライスからのデータ保持を決定するための除外基準に従います。プレコンディショニングベースライン中のフィールドEPSPスロープのベストフィットラインに大きなスロープ、プレコンディショニングベースラインの不安定性、およびポストコンディショニング期間の不安定性を示すスライスを除外します。
ベースラインでは、神経学的評価プロトコルまたはNAPスコアは、偽のmTBIラットと反復mTBIラットの間に差を示さなかった。すべての覚醒閉鎖頭部損傷セッションの後、繰り返されたmTBIラットは、偽と比較してNAPタスク内で有意な障害を示し、微妙でありながら重大な行動障害が発生したことを示しています。一連の対パルスを投与し、第1のフィールドEPSPに対する第2のフィールドEPSPのサイズの比を計算した。
ペアパルス比は、偽mTBIラットと反復mTBIラットの間で差がなく、反復mTBIラットは歯状回へのMPP入力の基本的なシナプス生理機能を変化させなかったことが明らかになりました。長期のうつ病を誘発するために10ヘルツプロトコルを投与した場合、損傷後初日に長期のうつ病を維持するための歯状回へのMPP入力の容量が一時的ではあるが有意に減少した。しかし、受傷後7日目までに、偽のmTBI動物と反復mTBI動物のスライスは同等の長期うつ病を示しましたが、反復mTBI動物が長期うつ病の増加を示すわずかな傾向を示しました。
解剖と切断のプロセスを事前に計画することは、実行可能な海馬スライスの作成に成功し、安定した電気生理学的記録を得るために重要です。この手順は、TBIの病態生理学を調べ、新しい治療手段を開発するために使用できる安定した実験プラットフォームを作成します。脳を切除してから、海馬横切片の圧縮フィルムをカットするために脳を配置するまでの動きは、歯状回における電極の正確な配置と同様に重要です。
