Y-27632 成人皮膚組織からのヒトメラノサイトの収穫量を豊かにする

細胞ベースのプロトコルの一般的な目標は、ヒトメラノサイト細胞を単離および培養し、従来の方法の欠点を改善することです。新しい方法から、材料や機器に基づいて、比較的短時間で大量の一次メラノサイト細胞を得ることができます。このプロトコルで使用されるヒト組織は、病院での割礼手術から廃棄され、2015年5月12日の日付である同研究所の人間研究倫理委員会番号2015120401のガイドラインに従って取り扱われる皮膚組織の新鮮な成人である。

これは、すべての必要な試薬の表示です。事前に無菌の器具や材料を準備し、皿に組織を設定し、30秒間75%エタノールで組織を洗浄し、洗浄液で5分間、それぞれが便利な部分に組織を切断し、脂肪層を除去するために外科用ブレードで組織をスクラップします。真皮側を下にして組織を平らにし、皮膚組織にスペース溶液を1ミリリットル当たり2.5ミリグラム加える。

一晩で4度でカバーし、保存します。2日目には、真皮から表皮を剥がし、すぐに表皮を洗浄液で別の3つの皿に移し、37度の水浴で30分間インキュベートしたチューブ内の0.05%トリプシンを水没させる。中和ソリューションの等量を追加します。

ピペットは溶液を上下に10〜15回行う。100マイクロメートルのマッシュフィルターを通して溶液を渡す。200回gで5分間遠心分離機は、tiva培地の10ミリリットルでセルパレットを再中断する上清を除去する。

Y-27632の10マイクロメートルを加えます。情報をマークすると、これが顕微鏡下の視野です。培地中に浮遊する細胞を37°Cのインキュベーターで示す。

このビューは、2 日目にセルが皿の底部を取り付け始めたビューを示します。そして、9日目の見解は、メラノサイトの明らかな堆積物が存在する。上清を除去し、PBSで細胞を洗浄し、0.05%トリプシンの2ミリメートルを2ミリメートルインキュベートし、中和溶液を2ミリリットル加えます。

200回gで5分間遠心分離機。上清を取り外し、10ミリのティバ培地でセルパレットをゆっくりと再中断します。2 日ごとにメディアを変更します。

これらの図は、1つのスケマティックダイアグラムの通路のビューを示しているので、新しい方法と従来の方法がこの図に示されています。組織の調製および新しい方法の消化のための手順は、従来の方法と同じです。唯一の違いは、単離された脂肪細胞が10マイクロメートルY-27632の存在下で彼女のtiva培地で10分で接種したということです。

2日後 Y-27632 でサプリメントなしのティバ メディアでメディアを交換します。.このパネルは、従来の方法の一番上の行で調製されたメラノサイトの代表的な画像を示し、最初の接種後3日目、6日目、8日目の新しい方法の下列では、3日目、6日目、8日目にメラノサイトの数を呼び出し、新しい方法はメラノサイトの収量を約5倍に増加させることがわかりました。8日間のカウンターの後、私たちはダースを行い、各単一の料理のメラノサイトの数を数えました。

その結果、新しい方法で単離されたメラノサイトの数は、従来の方法よりもはるかに多いことを示した。Ki67立ち位置は、新しい方法で単離されたメラノサイトが通常より重要に増殖できることを確認し、新しい方法でメラノサイトの正常な機能を得た。分離から最初の通過後にメラノサイトの純度を確認しました。

メラノサイトのみで表現したMITF発現のための一つのメラノサイトの通路。そして、最初の通過後に得られた純粋なメラノサイトを示すMITFに対して100%近くの細胞が陽性であることがわかった。新しい方法から分離されたメラノサイトをテストすることは正常に機能することができる。

90以上のインビトロで力冷でメラノサイトを処理し、力冷却がメラノサイトの色素沈着を誘発できることを観察した。これらのデータを一緒に取ることは、新しい方法から分離されたメラノサイトが通常色素沈着を生じることができることを示唆している。原発性メラノサイトは、皮膚および培養で拡張された皮膚上で述べたように、実験室研究および臨床応用のために容易に使用されてきた。

IDY-27632が2日前に初期培養培地に入り、メラノサイトのアウトを劇的に増加させることができると報告した。要約すると、我々は、純粋な原発メラノサイトを成体組織から分離する新しいシンプルで高効率な方法を確立することに成功した。