この研究は、前臨床環境での虫垂がんの治療法と病理生物学の研究への新しいアプローチを示しています。これらの方法は、他の悪性腫瘍の研究により広く適用できる可能性があります。虫垂がんは、疾患モデリングのためのマウスに虫垂がない場合の発生率が低いため、研究が困難です。
この技術は、腫瘍微小環境内の細胞相互作用の研究を可能にする。この方法は、結腸直腸癌や卵巣癌など、大網に転移する傾向がある複数の種類の癌の生物学を研究するために適用できます。輸送培地と培地を準備することから始めます。
組織が到着したら、腹膜偽粘液腫腫瘍組織を直径6センチメートルの皿を含む35の完全なDMEMに移します。液化したムチンや粘液性の高い組織領域を除去することに加えて、メスで切断するのが難しい組織を取り除きます。腫瘍組織の結節を大まかに1立方センチメートルの小さな断片に切ります。
アガロース調製および組織包埋のために、組織が到着した場合は同日にウシ胎児血清またはFBSを含まないPBS中の低融点アガロースの5%溶液を調製します。液体5%アガロース溶液を、標本を覆うまで、2〜3個の小さな腫瘍標本を含む6センチメートルの皿に加えます。埋め込まれたティッシュを摂氏4度の冷蔵庫に30分間置きます。
組織標本をビブラトムに取り外し、固化したオーガーを冷蔵庫から取り出し、メスを使用して組織の幅よりわずかに大きいアガロースキューブを切り取ります。ビブラトームステージに瞬間接着剤を塗布し、アガロースキューブを瞬間接着剤に1〜2分間そっと置き、固定します。ブレードをビブラトームに固定し、組織切片の厚さを約150〜250ミクロンに設定して、最適な下流イメージングを実現します。
組織スライスを培養するには、透過膜の上に2ミリリットルの完全DMEM培地を、透過膜の下に3ミリリットルの完全DMEM培地を加えて、透過性インサートプレートを作製します。次に、細い絵筆を使用して組織スライスをビブラトムの切断チャンバーからそっと持ち上げ、完全なDMEMを含む透過性培養皿に2〜4枚のスライスを入れます。スライスを摂氏37度で最大7日間、5%の二酸化炭素で培養します。
培地交換中、24時間ごとに、細胞殺傷のコントロールとしてボルテゾミブを追加し、テスト可能な化学療法5-フルオロウラシルまたは5-FUを培地に追加して薬理学的介入を実行します。共焦点イメージング解析用の腫瘍スライスを、1%FBSを含むPBSを含む12ウェルディッシュの単一ウェルに配置します。カルシウムイメージング実験では、PBSの代わりに、余分な細胞カルシウム溶液でスライスをインキュベートします。
サンプルをイメージング色素で染色して、組織スライスの生存率を判断します。生存率色素を添加した後、10分から1時間インキュベートします。インキュベーション後、スライスを1%FBSを含むPBSを含む光学的に透明なガラス底のペトリ皿に移し、共焦点イメージングデバイスでのイメージングに使用します。
1ミリリットルのピペットチップの端から小片を切り取って開口部を広げ、ピペッティングによる激しい機械的解離を可能にします。スライスを摂氏37度で1ミリリットルの消化バッファー中で5〜15分間回転させ、機械的解離を使用してインキュベーション中に2〜3回激しい組織破壊を行います。組織が消化されたら、50ミリリットルの円錐管の上に置かれた70マイクロメートルのフィルターに消化媒体で破壊された組織を移します。
滅菌鉗子またはピペットを使用して大きな部分を選びます。プラスチック製の5ミリリットルシリンジの鈍いバックエンドを使用して、解離していない大きなスライスをマッシュし、2%FBSを含む4ミリリットルのPBSで洗浄します。解離した細胞上清を取り、300Gで5〜10分間遠心分離します。
上清を除去し、2%FBSを含む1ミリリットルのPBSでペレットを洗浄する。フローサイトメトリー用のサンプルを調製するには、50マイクロリットルのヒトFCブロックを含むブロッキングバッファーを加え、室温で15分間インキュベートします。2%FBSを含む50マイクロリットルのPBS中のそれぞれの抗体を用いて細胞外染色を行う。
制御および治療条件のために5ミリリットルの完全な培地を分注します。透過性ディッシュにプレーティングされた2〜4枚のスライスに、対照処理アリコートからの培地と、下流の生存率、生死分析に使用する追加の併用療法を追加します。組織スライスを完全なDMEMを含む培養物に2〜5日間放置し、培地とボルテゾミブと5-FUを1日おきに交換します。
発光生存率分析のために、500マイクロリットルのPBSを12ウェルディッシュに加え、ペイントブラシまたは1ミリリットルのピペットを使用して、順次一致した組織スライスをPBS溶液に移します。スライスから PBS を削除します。条件ごとに500マイクロリットルの発光生存率溶液を加え、室温で30分間振とう機上でゆっくりと回転させてインキュベートしてから、発光プレートリーダーを使用して発光を読み取る。
組織切片中のムチン染色を、周期的酸シフト染色およびムチン特異的抗体を用いて可視化した。カルセインAMとヨウ化プロピジウムでのインキュベーションは、健康と生存率を決定しました。核は培養中に増殖した細胞と重なった。
これらの結果を定量化し、腫瘍スライス内の増殖細胞数を決定した。スライスをCD11b PE結合抗体およびFluo−4 AM中でインキュベートし、CTUで局所免疫細胞を標識した。細胞内カルシウムレベルを示す擬似カラースケーリング画像は、細胞内カルシウムの異なるレベルを視覚化することを可能にした。
強調表示されたCD11b陽性免疫細胞内の細胞間カルシウム応答の前、最中、後の自発的活動の追跡および経過時間がここに示されている。CD11b免疫細胞におけるカルシウム応答の生の痕跡を、他の応答性および非応答性細胞と共に定量化した。腹膜偽粘液腫を有する患者腫瘍サンプルのイムノタイピングの代表的な結果をここに示す。
腫瘍免疫プロファイルの定量化は、ドナー標本337が高レベルのM2マクロファージを有することを示し、腹膜由来組織切片の偽粘液腫を利用することで、患者の腫瘍試料の固有のドナー細胞景観の調査が可能になったことを示している。偽腹膜粘液腫ヒト組織からの組織スライスのファーマコタイピングおよび下流分析は、細胞毒性分析およびトンネル共焦点イメージングによって確認されるように、腫瘍スライスにおける細胞の死滅を示した。細胞傷害性薬物、ボルテゾミブおよび5-フルオロウラシルに応答して。
発光生存率分析は、順次一致したスライスを用いて行った。粘液性腫瘍からのスライスの製造を成功させるには、脂肪や高密度の腹壁組織などの細胞および無細胞組織成分の綿密な解剖と除去が必要です。この技術により、がん細胞と、脂肪、血管、免疫細胞の相互作用など、腫瘍微小環境における複数の細胞型との相互作用をモデル化することができます。
