日本脳炎ウイルス特異的TPFSの検出方法とフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考にした。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の2人の学生であるLinlin ZhangとMeng Zhangによって行われます。まず、モノクローナル抗体、CD28およびCD49d、CD107a、ゴルジプラグ、およびモネンシンの存在下で、濃縮不活化JEV粒子を摂氏37度で16時間刺激します。
次に、モノクローナル抗体、CD28およびCD49d、CD 107a、GolgiPlugおよびモネンシンの存在下で、濃縮ウイルス粒子を含まない対照群のPBMCを摂氏37度で16時間刺激する。各グループから細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。室温で500gで5分間遠心分離し、ピペットで上清を除去する。
細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。固定可能な生存率色素を細胞懸濁液に加え、暗所で室温で10分間インキュベートします。室温で500gで5分間遠心分離し、上清を除去した。
細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁した後、再び、室温で500gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を廃棄する。細胞表面マーカー染色を行うには、細胞を100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、各チューブの細胞懸濁液に2マイクロリットルの各表面マーカー抗体を追加します。チューブを光から保護しながら、室温で30分間インキュベートします。
500 gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を除去します。再度、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。室温で500gで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。
固定および膜破壊を行うには、500マイクロリットルの膜破壊固定液で細胞を再懸濁し、室温で暗所で20分間細胞を固定します。その後、500gで5分間遠心分離し、上清を除去します。細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁した後、室温で500 gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を注意深く除去します。
次に、細胞を100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、細胞内サイトカイン染色のために各チューブの細胞懸濁液に2マイクロリットルの各サイトカイン抗体を追加します。暗所で室温で30分間チューブをインキュベートします。再度、500gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を除去する。
もう一度、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。室温で500gで5分間遠心分離し、前述のように上清を注意深く除去します。次に、500マイクロリットルのPBSを加えて細胞を再懸濁します。
PBMCサンプルのみを単離した後、前に示したように、原稿に記載されている1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで細胞懸濁液を12等分します。同様に、細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカイン抗体を添加した後、前に実証したように、500マイクロリットルのPBSを添加して、細胞およびボルテックスを低速で再懸濁する。染色されていないサンプルを使用して、前方散乱、側方散乱、および異なる蛍光色素電圧を調整し、フローサイトメトリー補正を調整して、単一の染色サンプルを使用して異なる蛍光色素間の汚染シグナルを排除します。
前方散乱領域を通る多角形ゲートを描き、無傷のリンパ球集団を選択する側方散乱領域ドットプロット、破片を除外しながら、前方散乱領域を通る矩形ゲートと、前方散乱幅ドットプロットとを描き、単一細胞を選択する。次に、生細胞を選択するために生細胞を通る死側散乱領域ドットプロットを通る矩形ゲートを描き、CD3側散乱領域ドットプロットを通る矩形ゲートを描き、CD3つの陽性T細胞を同定した。次に、CD4、CD8ドットプロットを通してクワッドゲートを描画してCD4陽性またはCD8陽性T細胞を特定し、CD45RO、CD27ドットプロットを通してCD4陽性またはCD8陽性T細胞をTCMとTEMに細分化します。
CD107aのゲートを引いた後、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン2およびマイクロファージ炎症性タンパク質1αをCD8陽性またはCD4陽性のT細胞のTCMまたはTEMからそれぞれ異なる応答パターンの頻度を決定した。サンプルをサイトメトリーに順次ロードします。ゲーティング戦略を採用して、前方散乱領域幅、次に側方散乱領域ドットプロットを使用して、CD8陽性またはCD4陽性T細胞とそのサブセットのTCMまたはTEMを識別しました。
JEVに対するCD4陽性およびCD8陽性T細胞応答の多官能的特徴は、JEV刺激後のCD8陽性TCM細胞において、ワクチン未接種の小児と比較して、CD107a、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン2のレベルの増加が検出されたことを示した。しかし、マクロファージ炎症性タンパク質1アルファのレベルは、両群間で異ならなかった。より高いレベルのCD107aおよびインターフェロンガンマは、未ワクチン接種群と比較して、JEV刺激下でワクチン接種群のCD8陽性TEM細胞で検出された。
一方腫瘍壊死因子α、インターロイキン2およびマクロファージ炎症性タンパク質1αは、それらの陽性細胞において有意に上昇しなかった。JEV抗原は、ワクチン未接種群と比較して、ワクチン接種群のCD4陽性TCM細胞において、より高いレベルのCD107a、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子α、およびマクロファージ炎症性タンパク質1αを誘導することに成功した。しかし、インターロイキン2陽性細胞の割合は、JEV刺激下で2つの群間で異ならなかった。
CD107a陽性、インターフェロンガンマ陽性および腫瘍壊死因子α陽性サブセットの割合は、ワクチン接種群におけるサブCD4陽性TEM細胞は、未ワクチン接種群よりもJEVの存在下で高かった。刺激のT細胞免疫原性と互換性のあるカラーマッチング戦略は、このプロトコルの重要なステップです。
