このプロトコルは、タンパク質によるATP加水分解から生じる遊離リン酸を測定することにより、ATPアーゼタンパク質の活性の決定に役立ちます。マラカイトグリーンアッセイは、無機リン酸塩を検出するためのシンプルで高感度、高速かつ安価な手順です。ターゲットに対する化合物の自動化およびハイスループットスクリーニングに適しています。
この技術は、重要な抗がん標的であるHsp90タンパク質に対する阻害剤の迅速な発見において重要な役割を果たします。まず、40マイクロリットルの1ミリモルリン酸標準物質を960マイクロリットルの超純水にピペットで入れ、40マイクロモルのリン酸溶液を得た。製造元の指示に従ってこの溶液を追加して、0〜40マイクロモルのリン酸塩の段階希釈を形成します。
次に、測定可能なATPアーゼ活性のために8マイクロリットルの酵母Hsp90を使用します。ブランクとポジティブコントロールにマラカイトグリーン試薬を追加し、添加後のブランクとポジティブコントロールの光学濃度差が0.5以上1未満であることを確認します。ATPを調製するには、453.39マイクロリットルの超純水を含むバイアルに1ミリグラムのATPを移し、4ミリモルのストック溶液を得る。
ATPは時間の経過とともに自然に加水分解する可能性があるため、新鮮に準備します。各ウェルに4マイクロリットルのATPストック溶液を加えて、0.2ミリモルの最終ウェル濃度を得ます。マルチチャンネルピペットを使用して反応の最後の成分としてATPを追加し、すべての反応が同時に開始されるようにします。
次に、1ミリグラムを178.37マイクロリットルのDMSOに溶解することにより、10ミリモルのゲルダナマイシンストックを調製します。ストック溶液を使用して、段階希釈によりDMSO中の4ミリモル、0.8ミリモル、0.16ミリモル、0.032ミリモル、0.0064ミリモル、および0.00128ミリモル溶液を調製します。これらのストック溶液を2マイクロリットル各ウェルに追加して、0.1ミリモル、0.02ミリモル、0.04ミリモル、0.0008ミリモル、0.00016ミリモル、および0.000032ミリモルの最終ウェル濃度を得ます。
次に、ブランクおよびネガティブコントロールを含むウェルと共にウェルを調製する。ゲルダナマイシンを含有するウェルは、ポジティブコントロールとして機能する。96ウェルプレートを準備し、この波長での吸光度を記録するために、620ナノメートルの吸光度を示す化合物用に別のウェルを準備します。
ゲルダナマイシンは、このアッセイで使用される濃度に対して620ナノメートルの吸光度を示さないため、ゲルダナマイシンについては別のウェルを表示しないでください。各ウェルに超純水を添加してアッセイウェルを設置します。次いで、必要量のアッセイバッファーとゲルダナマイシン溶液等の化合物溶液を添加する。
Hsp90を適切なウェルに加え、プレートシェーカーで室温で2分間プレートを振とうします。マルチチャンネルピペットを使用して4マイクロリットルのATP溶液を追加します。プレートをアルミホイルで包み、プレートシェーカーで室温、200rpmで2分間振とうします。
プレートを摂氏37度で3時間インキュベートします。マルチチャンネルピペットを使用してATPと同じ順序で20マイクロリットルのマラカイトグリーン試薬を加えて反応を停止し、室温で15分間インキュベートします。最後に、プレートリーダーで620ナノメートルのプレートの吸光度を測定します。
プレートAを加えて、各ウェルに90マイクロリットルのアッセイバッファーを加える。プレートBを加えて、各ウェルにHsp90を含む90マイクロリットルのバッファーを追加します。プレートCを加えて、90マイクロリットルのATPを加え、さらにプレートDに、各ウェルに90マイクロリットルのマラカイトグリーン試薬を加える。
自動マルチチャンネル分注システムを使用して、添加プレートAの各ウェルからメインプレート1と2に、プレートBをメインプレート3と4に40マイクロリットルの溶液を移します。20マイクロリットルの溶液を化合物プレートの各ウェルからメインプレート1、メインプレート2、メインプレート3、およびメインプレート4に移します。プレートを200rpmのシェーカーで1分間振とうします。
20マイクロリットルの溶液を添加プレートCの各ウェルからメインプレート1、2、3、および4に移す。プレートを200rpmのシェーカーで1分間振とうします。プレートを摂氏37度で3時間インキュベートし、20マイクロリットルのマラカイトグリーン試薬を追加プレートDからメインプレート1、2、3、および4のウェルに移します。
室温で15分間インキュベートした後、プレートリーダーで620ナノメートルのプレートの吸光度を測定します。マラカイトグリーンの構造とマラカイトグリーン試薬Aと遊離リン酸との反応、およびその後の試薬Bとの反応を示します。標準リン酸塩濃度の標準プロットをこの図に示します。
ここで、x軸はマイクロモル単位の遊離リン酸塩またはπ濃度を表し、y軸には620ナノメートルでの吸光度が描かれています。エラーバーは、2つのサンプル番号間の偏差を表します。ATPase活性の割合は、ゲルダナマイシンによるタンパク質の用量依存的阻害を測定するために使用される。
ゲルダナマイシンは、0.85マイクロモルのIC50値で用量依存的にタンパク質を阻害することが観察された。ここで、各点は2つの決定の平均である。マラカイトグリーン剤を添加した後のメインプレート1における発色をこの画像に示します。
A11ウェルのピンク色は複合色によるものです。同様に、メインプレート2での発色をここに示します。A11ウェルのピンク色は、化合物の着色された性質によるものです。
ここでは、メインプレート3およびメインプレート4におけるマラカイトグリーン試薬を添加した後の発色を示す。ATPとマラカイトグリーン試薬をすべてのウェルに同時に添加することは、この手順を試みるときに覚えておくべき重要なことです。
