プロトコルは、予備段階の調査からより複雑な表面検査まで、ナノ粒子およびナノ構造表面の抗菌活性を調べる方法を提供します。研究間で比類のないデータをもたらした前述の方法とは異なり、これらの方法は、異なるナノ粒子材料、ナノ構造材料、および微生物種間で一貫した比較可能な結果を生成します。方法AおよびBにおいてナノ粒子の均一な分布を維持することは困難であり得る。
サンプルを徹底的にボルテックスすることでナノ粒子懸濁液を確保し、アリコート間で3〜4回ピペッティングすると懸濁液が維持されます 一晩増殖した細菌培養物1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに分注することにより、培養細菌の収集を開始します。十分な数のアリコートを作成した後、それらを遠心分離して目的の着座密度に到達します。上清を回収容器に集める。
そして、細胞ペレットを0.5ミリリットルの新鮮な増殖培地に再懸濁する。2本のチューブからの懸濁液を混ぜ合わせ、遠心分離を繰り返します。遠心化後、新鮮な増殖培地で2回目の洗浄を行い、チューブを遠心分離する前に、2本のチューブの内容物を1本に組み合わせることを繰り返します。
3回目の洗浄を0.33ミリリットルのトリス緩衝液またはヒドロキシエチルアミノメタン緩衝液で行います。それぞれ0.33ミリリットルの容量の3つの懸濁液を1つの1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機に混ぜ合わせます。遠心化後、ペレット化された細胞から上清を除去し、細胞懸濁液またはラグフェーズ細菌播種培養として知られる1ミリリットルの新鮮なトリス緩衝液に細胞ペレットを再懸濁します。
細菌およびナノ粒子培養物を形成するために、12ウェル非組織処理ポリスチレンプレートの各ウェルに2ミリリットルの細菌播種培養物を分注する。事前に秤量された酸化マグネシウム粒子を含む5ミリリットルのマイクロ遠心チューブごとに、3ミリリットルの細菌播種培養物を追加します。そしてチューブを短時間ボルテックスして、酸化マグネシウムナノ粒子を細菌と混合する。
混合後、1ミリリットルの酸化マグネシウムナノ粒子懸濁液を3つの別々のウェルに分注し、酸化マグネシウムナノ粒子の各事前測定重量の三重サンプルを作成した。サンプルを摂氏37度、120rpmで一晩インキュベートします。そして、ピペットを使用して3ミリリットルのサンプルを個々の15ミリリットルの円錐管に移します。
次に、適切な数の列に対して行Bから行Gの各ウェルに180マイクロリットルのトリスバッファーを加えて、96ウェルプレートで1〜10段階希釈を実行します。細菌サンプルを含む15ミリリットルの円錐管を短時間ボルテックスし、50マイクロリットルの細菌サンプルを行Aの個々のウェルに加えます次に、行Aから、20マイクロリットルの細菌サンプルを行Bの対応するウェルに移し、短時間混合します。滅菌ピペットチップを使用して、20マイクロリットルを行Bのウェルから行Cの対応するウェルに移し、行Gまでこれを続け、行Bの10から負の10から行Gの負の6への段階希釈を完了します。 プレート全体に広げて細胞培養物を分散させる。
ウェルプレートを摂氏37度で一晩インキュベーターシェーカーに入れ、寒天プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。プレートを調べ、約25〜300個のコロニーを有するプレートを数えます。可能であれば、同じ希釈値のプレートを選択してください。
試験する材料ごとに、増殖培地に3つの200マイクロリットルアリコートを3つのウェルに添加し、細菌培養液の200マイクロリットルアリコート3つを追加ウェルに追加のウェルに追加して、一晩細菌サンプルを希釈します。96ウェルプレートをプレートリーダーに入れてスキャンします。必要に応じて、600ナノメートルまたはOD600での光学密度が約0.01に達するまで、ブロスまたは一晩細菌培養液を添加し続けます。
細菌ナノ粒子懸濁液および滅菌培地ナノ粒子懸濁液を調製するには、15ミリリットルの円錐管の三重セットから1ミリリットルの細菌培養物または培地を除去する。そして、それを事前に測定されたナノ粒子を含む5ミリリットルの遠沈管に加えます。チューブをボルテックスして溶液を混合します。
5ミリリットルの遠沈管から15ミリリットルの円錐管に1ミリリットルのアリコートを移すことによって、ナノ粒子を均一に分配する。完了したら、各サンプル200マイクロリットルを96ウェルプレートの個々のウェルに分注します。前述の着座密度を決定した後、サンプルとコントロールを48ウェル非組織処理ポリスチレンプレートの個々のウェルに追加します。
次に、0.75ミリリットルの細胞懸濁液をサンプルとコントロールを含む各ウェルに分注します。48ウェルプレートをインキュベーターシェーカーに入れ、摂氏37度で24時間、120RPMで振とうします。インキュベーション後、各グループから2つのサンプルを収集し、標識された5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに個別に移します。
各チューブに2ミリリットルの改訂されたシミュレートされた体液(RSBF)を追加します。滅菌した亜硝酸セルロース紙を直径1センチメートルにトリミングして準備します。カットしたニトロセルロース紙を、適切な培地を含む寒天プレートに置きます。
次に、50マイクロリットルの希釈した細菌培養物をろ紙に加えてから、各サンプル表面の中央に50マイクロリットルの適切な培地を追加します。滅菌ピンセットを使用して、オーガーの表面から硝酸セロース紙を持ち上げます。硝酸セルロース紙を慎重に裏返し、細菌が50マイクロリットルの培地および目的のナノ構造表面に接触するようにサンプル表面に置きます。
サンプルが培養中に分解可能な場合は、トリスバッファーとの接触を避けるために、その下にホルダーを置いて持ち上げます。ウェルを含むサンプルに1ミリリットルのトリスバッファーを加えて湿度を維持します。一晩インキュベートした後、各サンプル表面からニトロセルロース紙を収集し、5ミリリットルのトリスバッファーに入れます。
収集したろ紙とナノ表面材料サンプルを5秒間ボルテックスします。サンプルからトリスバッファー懸濁液を採取し、個々の新鮮な収集チューブに入れます。方法Aを使用した抗菌効果により、酸化マグネシウムナノ粒子1ミリリットルあたり1ミリグラムの最小および阻害濃度(MIC)、およびグラム陰性大腸菌および緑膿菌に対してそれぞれ酸化マグネシウムナノ粒子1ミリリットルあたり1.0および1.6ミリグラムの最小殺菌濃度(MBC 99.9)が特定されました。
グラム陽性表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)は、それぞれ1ミリリットルあたり0.5、0.7、および1ミリグラムのMIC値を示しました。1ミリリットルあたり1.6および1.2ミリグラムのNBC 99.99値は、それぞれ表皮および黄色ブドウ球菌について同定された。MRSAはNBC90を超えて減少しませんでしたが。
1ミリリットルあたり1.2および1ミリグラムのMICは、薬剤感受性および薬剤耐性カンジダ種、CアルビカンスおよびCアルビカンスフルコナゾール耐性、またはFRでそれぞれ同定された。対照的に、酸化マグネシウムナノ粒子は、1ミリリットルあたり1および0.7ミリグラム、またはそれぞれC.グラブラタおよびCグラブラタエキノカンジン耐性、またはERのMIC値を示した。各候補種は1ミリリットルあたり0.7〜1.2ミリグラムのNBC 90に達しましたが、C.glabrata ERのみが1ミリリットルあたり1.2ミリグラムでNBC 99.9に減少しました。
方法Bでは、ナノ粒子に曝露されたMRSAは指数関数的に成長し、ODは0.85になりました。酸化マグネシウムナノ粒子1ミリリットルあたり1.2ミリグラムおよびトリメトプリム1ミリリットルあたり6.25ミリグラムへの曝露は、それぞれ80.2%および81.6%の細菌増殖の減少をもたらした。同様に、水酸化マグネシウムナノ粒子1ミリリットルあたり2.9ミリグラムは、細菌の増殖を70.3%に減少させ、バンコマイシン1ミリリットルあたり1マイクロリットルへの曝露は、MRSAの増殖の99.99%減少をもたらし、酸化マグネシウムおよび水酸化マグネシウムナノ粒子の静菌活性を示唆した。
方法Cは、間接接触による細菌増殖の阻害を示さなかった。結果は、ZC21が、テストされたすべてのサンプルについて、MRSAの接着と成長に対して最も強い抗菌活性を持っていることを示しました。方法Dでは、1.9A、1.9 AA、およびEPDサンプル、またはそれらのペアのろ紙に生存可能な黄色ブドウ球菌は特定されませんでした。
しかし、ひざまずいた後にEPDサンプルにさらされると、ナノ構造表面とパレッドろ紙上のいくつかの細胞への細菌の増殖が減少しました。ナノ粒子およびナノ構造表面の抗菌活性を特定することで、慢性創傷やインプラント関連感染症に関連するものなど、バイオエンジニアリングアプリケーションにおける追加の調査が行われました。
