脈絡叢の構成と構造についてより良い洞察を得るために、脈絡叢を脳室から分離する効率的な方法は、最初の非常に貴重なステップです。このマイクロダイセクション技術により、脈絡叢を周囲の組織で汚染することなく、その機能、生存率、および構造を含みながら、脈絡叢を脳室から解剖することが可能です。脈絡叢の分離における重要なハードルは、脳室に浮かんでいる構造を特定することです。
脈絡叢をブロモフェノールブルーで染色すると、単離が容易になります。手順を実演するのは、ラボマネージャーのエリエン・ヴァン・ウォンターゲムです。終末麻酔薬、経心灌流液、走査型電子顕微鏡(SEM)に必要な溶液、および本文に記載されているその他の溶液を準備することから始めます。
マウスの脳を隔離するために、終末麻酔された動物を背側褥瘡位置に置き、四肢をプレートに固定してマウスを固定する。70%エタノールをスプレーして胸部を消毒し、炭素鋼製の手術刃を使用して横隔膜のすぐ下を約4センチメートル切開します。皮膚を開き、外科用ハサミを使用して胸部を露出させます。
横隔膜を完全に開き、胸部を分離して肺と鼓動する心臓を露出させます。灌流ポンプを使用して、毎分4.5ミリリットルの速度で10ミリリットルの灌流溶液をマウスに経心灌流する。左心室に26ゲージの針を挿入して、溶液を全身回路に送り込みます。
外科用ハサミを使用して、血液が循環しないように右心房を切ります。マウスの断頭後、耳の間から目の上に切開を行うことによって頭皮を切り開いた。皮膚を横方向に引っ張って頭蓋骨を露出させます。
次に、鼻の部分に向かって扁平上皮縫合糸をたどって頭蓋骨を切り開きます。完了したら、脳を氷のように冷たいペトリ皿に入れ、1ミリリットルの氷冷PBSを脳組織に加えます。第四脳室に浮遊する脈絡叢を分離するために、メスを使用して小脳を大脳から静かに切断します。
小脳から残りの脳幹組織部分を取り除きます。切断線が上を向くように脳を回転させ、脈絡叢が背側にあるセクションの中央に第4脳室腔が見えるようにします。必要に応じて、鋭い鉗子で結合組織を引っ張って心室を開きます。
小さな鋭い鉗子を使用して、脈絡叢を心室壁からそっと引き裂きます。脈絡叢を側脳室から分離するために、小さな鋭い鉗子を使用して脳を2つの半球に矢状に切断します。切断線が上になるように1つの脳半球を回転させます。
側脳室を明らかにするために、視床から皮質をそっと引き離します。海馬を矢状中央切断線まで引っ込めます。側脳室が見えるようになり、脈絡叢が心室の下部にあります。
必要に応じて、鋭い鉗子で結合組織を引き開いて心室を少し開きます。小さな鋭い鉗子を使用して、脈絡叢を心室壁からそっと引き裂きます。SEM用のサンプル調製を行うには、新たに単離した脈絡叢を新たに作られた固定溶液に移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。
完了したら、3〜5ミリリットルの0.1モルカコジル酸ナトリウムバッファーを使用してサンプルをそれぞれ5分間3回洗浄します。サンプルを0.1モルのカコジル酸ナトリウムバッファー中の3〜5ミリリットルの四酸化2%オスミウムに30分間ポストフィックスします。次に、3〜5ミリリットルの超純水を使用して、サンプルをそれぞれ5分間3回洗浄します。
次に、エチルアルコール溶液あたり15分間、氷冷エチルアルコール濃度の増加シリーズでサンプルを脱水します。臨界点乾燥機を使用して、サンプルを適切に乾燥させます。カーボンステッカーで標本台紙にサンプルを注意深く配置し、SEMを使用して脈絡叢サンプルを視覚化します。
本プロトコルは、マウス脳外側および第4脳室からの脈絡叢の効率的な単離を容易にした。ブロモフェノールブルーとの灌流は脈絡叢の可視化をもたらした。ブロモフェノールブルーがさらなる処理工程で許可されなかった場合には、PBS−ヘパリンによる灌流または灌流なしが処理のために行われた。
脈絡叢上皮(CPE)細胞の表面のSEM形態学的分析は、第4脳室の2つの腕構造と、側脳室から分離された側脈絡叢の典型的なC字型形態を明確に示しています。SEM倍率を上げると、CPE細胞と微絨毛の頂端側に小胞様構造が認められ、SEMを用いてCPE細胞の病態変化を調査できることが示唆された。サンプルを周囲の組織と汚染しないように、脈絡叢組織に触れて取り出すだけです。
脈絡叢の構造を維持するために必要な注意を払ってください。単離された脈絡叢には、顕微鏡分析からトランスクリプトーム解析、フローサイトメトリーまで、さまざまな下流技術を適用してその構造と機能を調査できます。脈絡叢を脳からマイクロディスケーンすることで、この小さな脳組織の構造と機能についてより良い洞察を得ることができます。
この知識は、神経疾患におけるその役割をよりよく理解するために不可欠です。
