この方法論は、クリアリングプロトコルの改善とMesos PIMテクノロジーの光学セクショニングのアイ機能を組み合わせて、マイクロメートルの分解能でメゾスコピック再構成を実行できます。これは、元の3次元組織組織を失うことなく、1回のスキャンで巨大な心臓組織またはマウス心臓全体の溶液を画像化する可能性を提供します。心臓を近位大動脈でカニューレ挿入し、チロ溶液で洗浄し、0.01モルPBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定した後、クリアリングプロトコルを開始する準備が整います。
0.01モルPBSで摂氏4度で15分間心臓を3回洗います。このステップの後、心臓はPBSと0.01%アジ化ナトリウムに摂氏4度で数ヶ月間保存できます。心臓を20ミリリットルのヒドロゲル溶液中で、摂氏4度で3日間、15RPMで振とう状態でインキュベートします。
乾燥機、真空ポンプ、および乾燥機をポンプバンドと窒素パイプラインの両方に接続するチューブシステムを使用して、室温でサンプルを脱気します。サンプルを乾燥機に入れ、キャップをしたままバイアルを開きます。乾燥機を閉じ、窒素パイプラインを開いてチューブから酸素を取り除きます。
真空ポンプをオンにして、乾燥機から酸素を10分間除去します。ポンプの電源を切り、乾燥機のノブを窒素パイプラインに開きます。それから窒素タップを開けなさい。
圧力が大気圧に等しくなったら、乾燥機を慎重に開き、バイアルをすばやく閉じます。心臓を脱ガスヒドロゲル溶液に摂氏37度で約3時間安静に保ちます。ヒドロゲルが適切に重合され、完全にゼラチン状に見える場合は、心臓を注意深く取り除き、透明化溶液を入れたバイアル内の透明化溶液に入れます。
清澄化手順をスピードアップするために、3日に1回バイアル内の清澄溶液を交換してください。心臓が完全に透明になったら、それをバイアルから取り出し、50ミリリットルの温めたPBSで振とう状態で24時間洗浄します。振とう状態で50ミリリットルの1つのX PBS Tで24時間再度洗浄します。
サンプルを小麦胚芽アグルチニンAlexaフロア633の3ミリリットルあたり0.01ミリグラムで、室温で50 RPMで振とう状態で7日間インキュベートします。7日間のインキュベーション後、サンプルを50ミリリットルの1つのX PBS Tで室温で24時間振とうしながら洗浄する。サンプルを4%PFA中で15分間インキュベートした後、0.01モルPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
心臓を0.01モルPBS中の20%および47%TDEでそれぞれ8時間連続インキュベートします。そして最後に、0.01モルPBS中の68%TDEで、必要な屈折率1.46を提供します。外部クォーツキュベットの約80%を屈折率媒体で静かに満たします。
内部の石英キュベットに同じ屈折率媒体を充填します。サンプルを内部キュベットに浸します。細いピンセットを使用してサンプルをキュベットの底にそっと移動し、縦軸がキュベットの主軸に平行になるように心臓を配置して、スキャン中の組織全体の励起光路を最小限に抑えます。
2本のネジで内部キュベットの上にテーラードプラグを慎重に固定します。磁石を使用してサンプルを顕微鏡ステージに取り付けます。垂直サンプルステージを手動で移動して、内部のキュベットを外部のキュベットに浸します。
波長638ナノメートルの励起光源をオンにし、3ミリワットオーダーの低電力に設定します。電動トランスレータを使用してサンプルを移動し、組織の内板を照らします。HC imageライブカメラソフトウェアをオンにし、カメラトリガーを外部エッジトリガーライトシートモードに設定して、セットアップ全体を制御するカスタムソフトウェアによってカメラの取得トリガーを駆動します。
カメラソフトウェアで自動保存を有効にし、画像を保存する必要がある出力フォルダーを設定します。リニアトランスレータを使用してXY平面内のサンプル位置を手動で調整し、サンプルをカメラセンサーの視野の中心に移動します。リニア電動トランスレータを使用してサンプルをZ軸に沿って移動し、断層撮影再構成のための心臓の境界を特定します。
イメージングセッションを開始する前に、レーザー出力を約20ミリワットに増やします。イメージングソフトウェアのキャプチャパネルのスタートボタンをクリックして断層撮影を開始し、同時に電動トランスレータを使用して毎秒6マイクロメートルの等速でサンプルをZ軸に沿って移動し始めます。クラリティ法と屈折率媒体としてのTDEの組み合わせは、サンプルの最終体積を大きく変化させたり、サンプルの等方性変形を引き起こしたりすることはありません。
励起光学系は、視野の端で最大175マイクロメートルまで発散する約6マイクロメートルの最小廃棄物を有するライトシートを生成した。カメラのローリングシャッターとライトシート廃棄物の軸方向スキャンの同期により、ライトシートの廃棄物で励起されたサンプル部分でのみ発光信号を収集することが保証され、視野全体に沿って約6.7マイクロメートルの平均FW HMが得られました。顕微鏡のZ点広がり関数も蛍光ナノスフェアの断層再構成によって推定され、6.4マイクロメートルのFW H Mはフィットによって推定されました。
また、臓器全体で十分な信号対雑音比で単一の細胞膜を3次元で分解するシステムの可能性も確認されました。ガス除去手順は、プロトコルの最も重要なステップです。適切に実行されない場合、組織は洗浄溶液でのインキュベーション中に示される損傷に遭遇する可能性があります。
提示されたプロトコルは、マルチ染色プロトコルと組み合わせて、異なる生物学的構造を統合した臓器全体の再建を達成することができ、病理学的モデルの研究に適用することができる。
