この作品は、DoDのグラントPT074620（シャングリラホテル）とNIHグラントR01NS245014（シャングリラホテル）によってサポートされていました。

1。試薬の準備<ol><li> （アクティブな温暖化によってプロセスをスピードアップしていない）実験前に十分な時間を残して、濡れた氷の上で凍結したマトリゲルを解凍。 マトリゲルは、密接に細胞の移動に資する細胞外マトリックスに似た3D環境を確立するために使用される。それは、基板と包む機械の両方で細胞を提供する。マトリゲルは、-20℃で凍結保存されています使用する前に、それは徐々に0〜4の温度に育ったされるべき° C、すなわち、濡れた氷の上または冷蔵庫で解凍した。マトリゲルは、不可逆的インキュベーションの温度（37℃）でゲルを形成するために設定します。したがって、それは暖かい水で容器を浸漬することによって解凍をスピードアップすることは推奨されません。 </li><li>タンパク質画分は、生後0日（P0）フェレットの大脳皮質からの総タンパク質抽出物の等電点電気泳動（IEF）によって調製される。分離後、分画は、組織への毒性がある可能性が着目バッファの成分から抽出物をきれいにする20mMのトリス- HCl pH7.2に対して一晩透析している。 </li><li>タンパク質デリバリーシステム。 大脳皮質から抽出したタンパク質は、その後徐々に蛍光機能が微小球の視覚的な処理に役立つとのサイトからでも最低限の波及効果を容易に検出できることがわかったenvironment.Weするタンパク質を放出蛍光ラテックスビーズに吸着されています蛍光顕微鏡下で観察ビーズ預金、。 <ol class="lalpha"><li>タンパク質溶液の100 -200μlのために蛍光ビーズ10μlを追加する</li><li>シェーカー上で室温で暗所で30分間インキュベート</li><li>最高速度で1時間のためのベンチの遠心でビーズをスピンダウン</li><li>上清を除去</li><li>新鮮な培地の10μlを用いて渦の再停止</li><li>懸濁液にマトリゲルの30μlのを追加して、よく混ぜ、そして氷上に置きます。 </li></ol></li><li>バッファとメディア<ol><li>準備とろ過滅菌人工脳脊髄液（ACSF、水素化ナトリウム、塩化ナトリウム124mM、NaHCO 3を 26ミリメートル2 PO 4さ1.2mm、3.2mmのKClを、MgSO 4をさ1.2mm、CaCl 2で 2.4㎜、グルコース10mMの）。事前にACSFをスラッシュ-フリーズので、組織の解剖の時に準備ができた。 それを行うには、-80℃の冷凍庫で滅菌ACSFで満たされたプラスチック製のフラスコを置く。時々フリーズする監視ので、氷の層が壁の内側に蓄積するとき、それを分割し、流体と混合する。フラスコは、主に氷のスラッシュが含まれるまで繰り返します。バッファは、組織の生存をサポートするだけでなく、より長い低温を保持する、と分厚い氷のキューブよりも組織に機械的に少ない有害であるだけでなく、この方法を準備した。 </li><li> N - 2でNeurobasal培地を準備し、B - 27サプリメントは、製造業者の提案だけでなく、1mg/100mlゲンタマイシン、2mM L -グルタミン、および0.6％グルコースに応じて追加。 0.22μm膜を通して濾過によって滅菌する。 37℃保温° Cを使用するまで。 </li></ol></li><li>培養プレート<ol class="lalpha"><li>文化グレードプラスチック6ウェルプレートは、20μlのピペットチップを用いて冷マトリゲルの少量（2μlの約）と、その中心に各ウェルに点在し、それぞれのドロップでオートクレーブラウンド18ミリメートルのガラスカバースリップを配置することによって調製される。プレートもカバースリップのどちらも扱うそうでなければ文化になる必要があります。 </li></ol></li></ol> 2。組織の準備<ol><li>脳組織を取得<ol class="lalpha"><li>深くEuthasolで動物を麻酔した後、脳を除去し、氷冷ACSFに入れてください</li><li>メスで半球を分離し、氷冷ACSFを含む小さな皿にスライスを収集し、選択したデバイスを用いて500μmでcoronallyスライス</li></ol></li><li> （解剖顕微鏡を使用）外植片を作る<ol class="a"><li>神経節隆起（GE）とGEを介してカールして更なるステップを妨げる可能性のある皮質のトリム領域を含むスライスを特定します。 </li><li> GEの心室表面に近い領域に穴ハリスユニコアを押すと、主に脳室帯を含むコアを収納し、氷冷培地（図1）にプランジャーと一緒に排出します。0.5の3〜4片にはmmの直径は、単一のP0フェレットの脳のスライスにGEから行うことができます。げっ歯類、フェレットの両方で、内側と外側GEのがこの年齢で融合されることに注意してください。コアのスライスにとどまるまたは皿のプラスチック製の底部に付着されている場合は、コールドNeurobasal培地を含むシャーレにピペットとピペットチップとの転送でACSFを潮吹きでそれを動員する。濡れた氷の上に皿をおいてください。 </li><li>外植片が完全に浸漬し、気泡を避けているように注意しながら、別の皿に入れ、氷冷マトリゲルの大きな落ち込み（0.25〜0.5ミリリットル程度）に培地から外植片のバッチを転送する。濡れた氷の上に皿をおいてください。バッチのサイズは、ワークフロー下流の速度に依存します。 </li></ol></li></ol> 3。文化のセットアップ（解剖顕微鏡を使って） <ol><li>常に硬化を避けるために、マトリゲルと氷の上にマトリゲルを含むミックスをしてください。 </li><li>リミックスビーズ懸濁液を所定の位置以前にも20μlのピペットチップを用いて培養プレートに置かれたガラスのカバースリップの中央に氷冷マトリゲルのビーズ懸濁液の1 - 2μlの以下。それは少しを設定できるように、乾燥を避ける。 </li><li> 20μlのピペットチップを使用すると、マトリゲルドロップから2片を拾うと反対側に対称的にビーズ堆積物の所望の近傍（離れて預金の端から少なくとも1mm）の中に置いてください。それは、室温で5分より長くしないために設定させて。 手順bとcの右のタイミングが重要である。時間が短すぎるとそれは彼らがマトリゲルの最後の層で覆われているときに移動される文化のセットアップの不完全なゲル化し、コンポーネントにつながるだろう。時間が長すぎる場合には、ゲルと創造の過剰乾燥になることがあります細胞の自由な移動を妨げる物理的障壁 。 </li><li>植片（図2）を越えてそれを拡張し、ビーズとマトリゲルの30μlの約の平らな層を有する外植片をカバーしています。それは約15分間インキュベーターに設定してみましょう。 </li><li>サプリメントでNeurobasal培地の2ミリリットルを追加。 </li><li>毎日37℃、5％CO 2 / 95％O 2監視遊走活性でインキュベートする。 </li></ol> 4。ライブイメージング<ol><li> 3-4日間のインキュベーション後、培養プレートを見直し、興味のカバースリップを選択してください。外植片は、細胞の放射状に均一な雲を生成する必要があります。ライブイメージングで使用される新鮮な培養プレートに選ばれたカバースリップを交換してください。 </li><li>カバーガラスは一晩新しいプレートに座ってみましょう。細胞培養フードの中で、イメージングのための顕微鏡でプレートを配置する前に、カバースリップと細胞培養プレートの間に収集したマイクロバブルを放出させるためにカバースリップを移動するために滅菌スパチュラを使用してください。気泡の干渉は、イメージを台無しにする。ウェルの中央にカバースリップを移動します。 </li><li>蒸発を防ぐために、水と井戸の間にスペースを埋める。 </li><li>ウェルの中央からカバースリップを移動しないよう慎重に顕微鏡に細胞培養フードからプレートを転送する。 </li><li>イメージングソフトウェアを使用してイメージングスキームを定義する。 文化のセットアップの三次元性のために細胞はまた、垂直方向に移動し、したがって、移行の雲の完全な深さをencompassing Z - planesを収集することが重要です。画像化された領域のXYの範囲も相対的植の角度方向と遊走細胞を記録するために、録音の過程で移行する細胞によって移入されると予測領域をカバーするために、順番にビーズ預金を含むのに十分な大きさに設定する必要があります蛋白質の源。また、よりイメージ化されたZ面、またはそれ以上の面積が、それはサンプルと細胞追跡の時間分解能の損失の間に長い時間間隔を強制的に、特定の時点でサイクルを記録するためにかかる多くの時間をカバーすることを検討してください。私たちのケースでは、10倍の対物レンズを用いて、最適なスキームは、30分の間隔で、10の各Z -平面毎に20μmの間隔で配置するための3x3のタイルの録音だった。我々は彼らの動きの信頼性の追跡のために重要な、連続するタイムポイントで細胞の明確な同定を可能にするその最長30分の間隔を発見した。 </li><li>タイムラプスイメージングを開始する。 </li><li>希望時間後、プレートを取り外し、4％リン酸緩衝パラホルムアルデヒド中で培養を修正。さらに、形態学的および免疫細胞化学的解析に使用することができます。 </li></ol> 5。運動の解析<ol><li> TIFFは、ほとんどのポータブル一つである、さらなる処理のための最も便利な形式に画像の記録時系列に変換します。 </li><li> XY座標を記録することによって、時間をかけて個々の細胞の動きを追跡する。 これは、マニュアルトラッキングプラグイン、またはそのようなImagePro、VolicityまたはAutoQuantなどの他の商用アプリケーションでImageJのように自由に利用できるソフトウェア（NIH）を使用して行うことができます。 </li><li> Excelや社内で開発したソフトウェアを使用してトラックをプロット。 </li><li>各追跡対象のセルは、平均速度、パスの曲率、時間をかけて方向性のばらつき、分岐、蛋白質の源に向かって偏差として運動パラメータを計算するため、などの計算は、MS Excel、またはそれと同等のスプレッドシートで行うことができます。彼らはそれらよりも高度な分析手法の、より柔軟なカスタマイズと含めることができるように我々の経験は、それが社内のスクリプトを（R、MATLAB、PythonやPerlやその他、ほとんどのオープンソース言語を使用して）開発するためにはるかに生産的であることしかし示しますExcelの基本的なインストールで利用できる。 </li></ol> 6。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。解剖学的origiのダイアグラムn個の外植片の。これはhemisectedフェレットの脳の冠状切片の描画です。灰色の円は、外植片が取られる領域を示している。 <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。文化のセットアップの図。ビーズ堆積物は、タンパク質の供給源であり、外植片は、いずれかの側に配置されており、すべての要素をマトリゲルで覆わ​​れている。 <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。象限によって着色されたセルのトラックの対応するプロット（ビーズ預金に向かって矢印のポイント）。右上のセルのトラックは、細胞を引き付けるために表示される割合Dに向かって移行して、左側の細胞が遊走する細胞を撃退するために表示される小数部に向かって移行しています。 <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。外植片から遊走細胞の成長クラウドを表示する選択した時点においての画像のA）シリーズ。 （スケールバー200μmの）下に示すように矢印で示されている例のセルが、、時間によって追跡されます。この外植片は38時間にわたってライブイメージングで可視化した最終的な画像に画像を記録するの最初から外植片を残して細胞のイメージがあるここに示されている。B）常に部分に示されているセルが示された。セルは、反復的な分岐を（スケールバーは50μmの）を示しています。

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	<li>Caviness, V. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cortical+development:+a+view+from+mutations+in+mice.">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li><li>Gelman, D. M., Martini, F. J., N&#243;brega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons.">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li><li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia.">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li><li>Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., G&#246;tz, M., Offermanns, S., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+mutants+reveal+a+role+for+semaphorin+receptors+of+the+plexin-B+family+in+mechanisms+underlying+corticogenesis.">Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis.</a> Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riding+the+glial+monorail:+a+common+mechanism+for+glial-guided+neuronal+migration+in+different+regions+of+the+developing+mammalian+brain.">Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain.</a> Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+neuronal+migration.">Central nervous system neuronal migration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).</li><li>Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes.">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).</li><li>M&#233;tin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Moln&#225;r, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+pattern+of+tangential+neuronal+migration+during+forebrain+development.">Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development.</a> Development. 134, 2815-2827 (2007).</li><li>Martini, F. J., Valiente, M., L&#243;pez Bendito, G., Szab&#243;, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li><li>N&#243;brega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmitotic+Nkx2-1+controls+the+migration+of+telencephalic+interneurons+by+direct+repression+of+guidance+receptors.">Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors.</a> Neuron. 59, 733-745 (2008).</li><li>Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+directions+for+neuronal+migration.">New directions for neuronal migration.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).</li><li>Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia.">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+neural+cell+migration.">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li><li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+neurotrophins+into+the+central+nervous+system+using+fluorescent+latex+microspheres.">Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres.</a> Biotechniques. 23, 928-937 (1997).</li><li>Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissive+corridor+and+diffusible+gradients+direct+medial+ganglionic+eminence+cell+migration+to+the+neocortex.">Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).</li><li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+cortical+interneuron+subtypes.">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li></ol>

動物の使用：動物に関わるすべての手続きがUSUHSとNIH機関のガイドラインにしたがって実行し、USUHS IACUCによって承認された。

ここでは、化学物質の合図に応答する神経細胞の遊走挙動を研究し、分析するためにシンプルなシステムを提示する。vitroでの遊走アッセイでは細胞の運動に影響を及ぼす細胞外分子を識別するために使用されています。私たちのパラダイムは、検討した各々のセルが相互作用する3次元（3D）の環境を持つことが保証されます。 それは、細胞外マトリックス（例えばヒルシュら &#39;10との相互作用のため、欠けている、ポリ- D -リジンコートしたカバースリップの平らな面に移動を余儀なくされている細胞は、外植片からの移行の文化上のかなりの利点である、8。メティンら &#39;07）。細胞が縦方向に水平方向の自由と比較して下部のガラスのカバースリップと比較的薄いマトリゲル、の上面との間のスペースに制約されているとして、しかし追跡移行する細胞の大規模に関しては、それは、2次元のまま移行の。そのような設定はまだ本質的に2次元のままの動きを簡単に解析、することができます。 。マティーニら 、コラーゲンやマトリゲル中に埋め込 ​​まれたGEの細胞のGEの外植片または再集計で構成される同様の3Dパラダイムは、以前に化学物質の手がかりのソース（例えばLiodis ら &#39;07として特定のシグナル伝達タンパク質を発現する細胞の集合体を使用して、採用されたら&#39;09、。。。ノブレガ-ペレイラら &#39;08、Wichterle ら&#39;03）。。タンパク質が時利用可能な量のシステムが特に適して、培地に直接添加よりも高い場合、ローカル環境の持続的なレベルを可能にするために付着したタンパク質を持つラテックスビーズの形で徐放システムを採用してここで紹介する方法、タンパク質は限られているかタンパク質の複雑な混合物がテストされている場合。ビーズの選択は、ラテックスベースの製品に限定し、また他の材料、例えば、アガロースビーズ、それぞれ異なる特性を持つが含まれていません。さらにアッセイの密度を高めるために、我々は反対側にビーズの堆積物に並列したtwo植片を使用。起源の特定の領域を確保するために、我々は細胞のソースとして神経節隆起の外植片を使用している。我々は、神経節隆起の内側と外側部分の違いを評価したが、違いを見ていない。我々は、本研究では、フェレットを使用していることを指摘しておきますが、この種では内側と外側神経節隆起は、げっ歯類（。Poluchら &#39;08）よりも前のヒューズ。文化が作られた時間（P0）で内側と外側神経節隆起は新皮質の移入多くの細胞がまだ生成され、移行されているにもかかわらず、融合させた。細胞の真に均質なソースが好まれている場合は、、細胞懸濁液は、解剖組織から調製することができ、直接マトリゲルと混合、あるいはスピンダウンし、得られたペレットは、&quot;植&quot;を作るためにパンチ。タンパク質分解活性のさえ残存痕跡が実験の過程でマトリゲル液化できるため、細胞懸濁液を調製するための酵素組織消化の使用は、推奨されていません。また、デューデリジェンスは、文化のセットアップのタイミングに適用する必要があります。マトリゲルは、温暖化の期間は、乾燥空気の原因と遊走細胞を通さないで、消去することができるシェルの結果にマトリゲルの小滴の露出（としてこのプロトコルで使用されている）の少しでも長期間を重合するために必要ですが、新鮮なマトリゲルとその後の被覆による。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</td><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> Neurobasalミディアム（1X）、液体</td><td>インビトロジェン</td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N - 2サプリメント（100X）、液体</td><td>インビトロジェン</td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B - 27サプリメント（50X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 0080085 - SA </td><td></td></tr><tr><td> BDマトリゲル基底膜マトリックス</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td>ハリスユニコアは0.5mmサイズ</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 69036〜05 </td><td>パンチ穴</td></tr><tr><td>グリーンRetrobeads IX </td><td> Lumafluor、（株） </td><td></td><td>ラテックス微小球</td></tr></tbody></table>

migratory behavior of cells generated in ganglionic eminence cultures

細胞の遊走は、脊椎動物の中枢神経系の発達と成熟（ハッテン、&#39;99）につながる一般的なプロセスです。興奮性と抑制：大脳皮質は、2つの基本的なニューロンタイプで構成されます。これらの細胞は、異なる領域で発生し、別の経路に沿って皮質（パールマンら 、&#39;98）に移行する。抑制性介在は主に神経節隆起（。。Xu ら 、&#39;04。ゲルマンら 、&#39;09）のさまざまな地域から、接線方向に皮質下のソースからの移行。 （;ハッテン、&#39;90、ラキッチ、&#39;90キャヴィネス＆ラキッチ、&#39;78）彼らの運動は、大脳皮質における適切な細胞構築との接続の確立を可能にするために、環境手がかりによって課された精密時空間制御を必要とします。 in vitroにおける新生児フェレットの神経節隆起（GE）の増殖のゾーンで生成された細胞の遊走挙動を調べるために、我々は、BDマトリゲルマトリックスの3次元培養の配列を使用する。文化のセットアップは、2つのGEの外植片とテストされた蛋白質の源大脳皮質から抽出し、外植片（。。;リドルら 、&#39;97 Hasling ら 、&#39;03）との間に位置する蛍光ラテックスRetrobeads IXに吸着したから成っていた。文化の2〜3日後、細胞は半径方向に組織を残す傾向を示す片の端に現れ始めます。ライブイメージングは​​、細胞をラベルやマーキングの必要性なしに移住パターンの観察を可能にした。等時間隔的なフェレットの大脳皮質から得られた抽出タンパク質の分画にさらされた場合、GEの細胞は、個々の移動細胞の定量的動態解析によって判断すると異なる動作を表示します。

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Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

3D組織培養のタイムラプスイメージングは​​、大脳皮質から分画されたタンパク質抽出物に反応して、神経節隆起に由来する個々の細胞の遊走挙動を調べることができます。

神経節隆起を培養で生成された細胞の遊走挙動

Migration of cells is a common process that leads to the development and maturation of the vertebrate central nervous system (Hatten, '99). The cerebral ...

migratory-behavior-of-cells-generated-in-ganglionic-eminence-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K ビュー.  Uniformed Services University. 3D組織培養のタイムラプスイメージングは​​、大脳皮質から分画されたタンパク質抽出物に反応して、神経節隆起に由来する個々の細胞の遊走挙動を調べることができます。

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em&gt;インビボ</emマウス脊髄の&gt;イメージング

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

UV反射構造を検出してのSailFinモリーを使用して、メイト優先でその重要性を決定するためのアッセイ<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Measuring and Manipulating Functionally Specific Neural Pathways in the Human Motor System with Transcranial Magnetic Stimulation

Understanding interactions between brain areas is important for the study of goal-directed behavior. Functional neuroimaging of brain connectivity has provided important insights into fundamental processes of the brain like cognition, learning, and motor control. However, this approach cannot provide causal evidence for the involvement of brain areas of interest. Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a powerful, noninvasive tool for studying the human brain that can overcome this limitation by transiently modifying brain activity. Here, we highlight recent advances using a paired-pulse, dual-site TMS method with two coils that causally probes cortico-cortical interactions in the human motor system during different task contexts. Additionally, we describe a dual-site TMS protocol based on cortical paired associative stimulation (cPAS) that transiently enhances synaptic efficiency in two interconnected brain areas by applying repeated pairs of cortical stimuli with two coils. These methods can provide a better understanding of the mechanisms underlying cognitive-motor function as well as a new perspective on manipulating specific neural pathways in a targeted fashion to modulate brain circuits and improve behavior. This approach may prove to be an effective tool to develop more sophisticated models of brain-behavior relations and improve diagnosis and treatment of many neurological and psychiatric disorders.

This article describes new approaches to measure and strengthen functionally specific neural pathways with transcranial magnetic stimulation. These advanced noninvasive brain stimulation methodologies can provide new opportunities for the understanding of brain-behavior relations and development of new therapies to treat brain disorders.

経頭蓋磁気刺激によるヒト運動系における機能的特異的神経経路の測定と操作

Understanding interactions between brain areas is important for the study of goal-directed behavior. Functional neuroimaging of brain connectivity has ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has examined the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory. Here we present a protocol that combines mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to examine how mindfulness meditation changes behavioral performance and the neural correlates of episodic memory. Subjects in a mindfulness meditation experimental group were compared to a waitlist control group. Subjects in the mindfulness meditation experimental group spent four weeks training and practicing mindfulness meditation. Mindfulness was measured before and after training using the Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ). Episodic memory was measured before and after training using a source recognition task. During the retrieval phase of the source recognition task, EEG was recorded. The results showed that mindfulness, source recognition behavioral performance, and EEG theta power in right frontal and left parietal channels increased following mindfulness meditation training. In addition, increases in mindfulness correlated with increases in theta power in right frontal channels. Therefore, results obtained from combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG reveal the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Here we present a protocol for combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to understand the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

行動とEEGを組み合わせて、エピソード記憶に対するマインドフルネス瞑想の効果を研究する

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...