ゼブラフィッシュ細胞株を用いた細胞毒性アッセイプロトコルは、魚に対する化学物質の急性毒性に関する質問に答えたり、他の代替魚アッセイの適切な試験濃度を定義するのに役立ちます。この96ウェルプレートアッセイの主な利点は、生態毒性研究において重要な魚種であるゼブラフィッシュ細胞の細胞毒性を決定するために、異なる生存率エンドポイントを組み合わせることです。プロトコルは非常に単純です。
説明されているすべての手順を正しく実行すれば、問題は発生しないはずです。このプロトコルは、胚細胞の肝細胞など、さまざまな臓器またはライフステージに由来する魚細胞株への影響を評価する動物ベースの生態毒性研究を達成するのに役立ちません。ZEM2SまたはZFL細胞のプレーティングを開始するには、アッセイに必要な細胞数を得るために必要なそれぞれの細胞懸濁液の体積を計算します。
滅菌試薬リザーバーに、対応する細胞株用の完全培養培地を満たし、計算された容量の細胞懸濁液をリザーバーに移し、総容量20ミリリットルにします。マルチチャンネルピペットを使用して、泡や泡を形成せずに溶液を上下に穏やかに混合します。次に、マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、透明ポリスチレン96ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞懸濁液を添加し、ZEM2S細胞についてはウェル当たり60, 000細胞、ZFL細胞については1ウェル当たり40, 000細胞の生細胞数を得た。
プレートを摂氏28度で24時間インキュベートします。いずれかのタイプの細胞を異なる濃度の試験化学物質にさらすには、ウシ胎児血清またはFBSを含まない目的の細胞株の培養培地中に所望の濃度の試験化学溶液を調製します。24時間のインキュベーション後、マルチチャンネルマイクロピペットを使用してウェルから使用済み培地を慎重に廃棄します。
次に、ウェルごとに100マイクロリットルの特定のテスト薬液をテクニカルトリプリケートで追加します(これは、テスト化学物質濃度ごとに3つのウェルを意味します)。コントロールグループを、テクニカルトリプリケートのテスト化学物質と同じプレートに配置します。ブランクコントロールの場合、3つの無細胞ウェルに100マイクロリットルの暴露培地を追加します。
ネガティブコントロールの場合、細胞を含む3つのウェルに100マイクロリットルの曝露培地を追加します。ポジティブコントロールの場合、細胞を含む3つのウェルを、曝露培地で調製した1%Triton X-100溶液に曝露します。培地の蒸発を防ぐためにパラフィルムまたは接着剤シーリングホイルでプレートをシールし、プレートを摂氏28度で24時間インキュベートします。
試験化学物質暴露の24時間後、内容物を収集トレイに注ぎ、各ウェルを200マイクロリットルのPBSで洗浄することにより、ウェルから暴露媒体を注意深く廃棄します。次に、細胞を失うことなくPBSを除去するために、慎重に収集トレイに注ぎます。Alamar Blue または AB および CFDA-AM アッセイを実行するには、ウェルあたり 100 マイクロリットルのそれぞれの溶液を加え、プレートを摂氏 28 度の暗所で 30 分間インキュベートします。
次に、蛍光プレートリーダーで、本文に記載されている適切な励起波長と発光波長で蛍光を測定します。ニュートラルレッドまたはNRアッセイを実行するには、ミリリットルあたり40マイクログラムの濃度のNR作業溶液を取り、600 Gで10分間遠心分離します。次に、内容物を収集トレイに注いで、以前に追加したABおよびCFDA-AM溶液をウェルから慎重に取り出します。
マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、ウェルあたり100マイクロリットルのNR作業溶液を加え、プレートを摂氏28度で3時間インキュベートします。インキュベーションが終了したら、NR溶液をプレートから収集トレイに注意深く注ぎ、ウェルあたり150マイクロリットルのPBSを加えてウェルを洗浄します。洗浄後、1ウェルあたり150マイクロリットルのNR抽出溶液を加え、プレートリーダーを使用して540ナノメートルの吸光度を測定する前に、プレートシェーカーで10分間静かに振ってプレートをインキュベートします。
MTTアッセイを実行するには、24時間の試験化学物質暴露後、内容物を収集トレイに注ぎ、マルチチャンネルマイクロピペットを使用して暴露媒体を注意深く取り除き、暗所でウェルあたり100マイクロリットルのMTT作業溶液を追加します。プレートを摂氏28度で暗所で4時間インキュベートします。次に、内容物を収集トレイに注ぎ、100マイクロリットルのDMSOを各ウェルに加えてホルマザン結晶を抽出してMTT溶液を廃棄します。
プレートリーダーを使用して517ナノメートルの吸収を測定する前に、プレートシェーカーでプレートを10分間インキュベートします。APアッセイでは、ブランク、ポジティブコントロール、および高細胞毒性濃度の試験化学物質に対応するウェルは、青色および低蛍光を示し、生存細胞の不在または減少のいずれかを示しました。対照的に、多数の生細胞を含む低細胞傷害濃度の試験化学物質および陰性対照に対応するウェルは、レサズリンをより高い蛍光を有するピンク色のレゾルフィンに変換した。
NRアッセイでは、細胞毒性の高い濃度の試験化学物質とポジティブコントロールは透明または淡いピンク色で吸光度が低く、NR色素を保持している生細胞を含むウェルは濃いピンク色と高い吸光度を示しました。同様に、MTTアッセイでは、生細胞のないウェルは透明ですが、生細胞を含むウェルはMTTを紫色のホルマザンに変換します。計算された細胞生存率パーセンテージに基づいて、ZFLおよびZEM2S細胞株における異なる試験化学物質について、半分の最大阻害剤濃度またはIC50値を推定した。
FBSの有無にかかわらず培養液の細胞生存率に有意差は認められず、24時間の化学物質曝露期間におけるFBSを奪われた培地の適合性を示した。MTTおよびNRアッセイは、細胞生存率に対するDMSO濃度の0.1%から1%の変化による有意な影響を示さず、これらの細胞株が最大1%の溶媒としてのDMSOの使用をサポートすることを示しています手順全体で自己剥離を避けるために、播種細胞を取り扱う際には特に注意し、色素の沈殿を避けるために中性赤色の作業溶液を慎重に調製してください。この手順は、in vitroモデルを使用して魚に対する化学的影響のいくつかの側面に対処する研究に適用でき、動物ベースの生態毒性研究の進歩に貢献します。
